最终报告
常见致病菌检验及报告方式：
（1）将血液细菌培养瓶置35℃孵育箱中孵育，每日观察一次，连续观察至第七天。注意血液细菌培养瓶的变化。
（2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查，发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告。
（3）如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。需氧培养瓶接种羊血琼脂平板、巧克力血琼脂平板，前者作普通需氧培养，后者放入5% CO2环境35℃孵育24h；厌氧培养瓶接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，前者置厌氧环境进行35℃48h厌氧培养，后者作普通需氧培养。观察菌落生长情况。
（4）对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性，如为革兰阴性杆菌，进行氧化酶试验，触酶试验和硝酸盐还原试验，氧化酶阴性，触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种KIA、MIU培养基。KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作玻片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，选择相应试验进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，按非发酵菌进行鉴定。
（5）对细菌菌落涂片、革兰染色，发现革兰阳性球菌，葡萄串样或散在排列，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶试验阴性，链状或散在排列，或成双排列，初步判断为链球菌属或肠球菌属，选择相应试验进行鉴定。
（6）报告方式 在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有××细菌生长”；经分离培养，生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养×天，有××细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生长迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌学培养七天，无细菌生长”。
注意事项：
1．一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉
汤增菌液，以中和四环素、链霉素、新霉素、多粘菌素等抗生素，并添加抗菌物质拮抗剂如5%对氨基苯甲酸（PABA）拮抗磺胺类、100IU/50ml青霉素酶破坏青霉素和加入0.03~0.05%聚茴香脑磺酸钠（SPS）灭活氨基糖苷类及多肽类抗生素。
2． 对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目翻种后无菌生长，方可报告阴性。
3．为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目翻种两次，第一次在标本孵育12~18h后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种需氧培养均需接种羊血平板和巧克力琼脂平板；厌氧培养接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。
4．血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据。常见的病原菌见表5-2。在同一患者的2份血液标本中检出同一细菌；或检出细菌的患者2~3周后血清中的相应抗体升高则可作出肯定的病原学结论。一般菌血症由一种细菌引起，但也有同时两种细菌的混合感染、两种细菌或细菌和真菌的先后交替感染情况，有时也会出现不常见的细菌，这些情况不能随意判定为污染菌。
5．采血次数及间隔：在脑膜炎、细菌性肺炎等需马上开始抗菌治疗的急性发热性疾病；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等需紧急手术的患者，应立即从两臂分别取2份标本作血液细菌培养。对心内膜炎患者，在24h内采血3次，每次间隔不少于30min；必要时次日再采血2次。对不明原因发热者两次抽血间隔60min；
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必要时于24~48h后再抽血2次。因为1次血培养不足以说明问题，且会遗漏阳性结果。
尿标本检验： 标本采集： 正常人的尿液是无菌的，但在尿道口及外阴部位存在正常菌群，在采集尿液标本时，极易引起污染。应遵守无菌操作，避免正常菌群的污染。常用的采集方法有以下几种：
（1）中段尿采集法：是临床上最常采用的方法。女性患者先以肥皂水清洗，而后用1：1000的高锰酸钾水溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿10~20ml于无菌容器中加盖送检。男性患者应翻转包皮，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿10~20ml于无菌容器中加盖送检。
（2）导尿法：用导尿管导尿收集10~20ml尿液。可以避免污染，但患者难以接受，而且有诱发逆行感染的危险。
（3）肾盂尿收集法：由泌尿科医师在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液。
（4）膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，在患者耻骨联合上用碘酒、酒精消毒后，以无菌注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者。
（5）留尿法：留取24小时尿液，取沉淀部分约100ml送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。
检验程序：
直接计数 涂片 G染色
菌落计数
纯培养 血琼脂平板 麦康凯平板
初步报告
初步报告
定量培养 直接药敏尿液标本
离心沉淀 分离培养 涂片G染色
硝酸盐还原试验 快速检验
初步报告
菌落特征、涂片染色
生化反应 血清学凝集 药敏试验
最终报告
常见致病菌检验及报告方式：
（1）尿液的菌落计数
1）直接计数法：将尿液标本混匀，取一滴尿液于载玻片上，覆盖盖玻片，用相差显微镜观察每个视野的
细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有100个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥107菌数/ml，每视野有10个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥105菌数/ml，每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥104菌数/ml；可同时观察细菌的形态和运动情况。也可将0.001ml尿液涂布在玻片上进行革兰染色，
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用油镜观察，如每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥105菌数/ml。
2）定量接种法：用定量接种环取尿液，在血平板上连续划线接种；或用无菌移液器吸取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取0.1ml于血平板上涂布接种，35℃孵箱中孵育18~24h，计数平板上生长的菌落数。再计算每毫升尿液中细菌数。
每毫升尿液中细菌数=平板上的菌落数×1/接种环含尿量（ml）
3）倾注培养法：取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取1ml于无菌平皿中，加入已溶化并冷却至50℃的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固后35℃孵箱中孵育18~24h，计数平板上生长的菌落数。乘上100即得每毫升尿液中的细菌数。
4）报告方式：平板上如有细菌生长，计数菌落后，报告“每毫升尿液中细菌数为××”；如无细菌生长，经48h培养后仍无细菌生长，报告“普通需氧培养48h无细菌生长”。
（2）普通需氧培养：
将尿液标本离心，取沉淀接种于血琼脂和麦康凯平板，35℃孵育18h~24h，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果，如为G杆菌，进行氧化酶试验、触酶试验和硝酸盐还原试验。氧化酶阴性、触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种KIA、MIU培养基。KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作玻片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，选择相应试验进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，按非发酵菌进行鉴定。
如为G球菌，葡萄串样或散在排列，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶试验阴性，链状或散在排列，或成双排列，初步判断为链球菌属或肠球菌属，需观察血平板上菌落形态和溶血情况，以及麦康凯平板上是否生长。进一步进行胆汁七叶苷和6.5%氯化钠生长试验，以确认肠球菌属；如为链球菌属则需进行杆菌肽敏感试验、CAMP试验、马尿酸钠试验等及血清分型试验鉴定之。
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（3）淋病奈瑟菌：
接到标本后立即将尿液标本离心，取沉淀接种于置35℃预温的淋病奈瑟菌选择性培养基中，35℃5%CO2孵育18~24h观察结果，若无细菌生长则继续孵育至48h，若有小而隆起、透明、湿润的可疑菌落，选择相应试验进行鉴定。在接种同时取沉淀涂片革兰染色镜检，若发现有G肾形双球菌，存在于脓细胞内外，则可报告“查见细胞内（外）G双球菌，疑似淋病奈瑟菌”。
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（4）结核分枝杆菌：
将尿液标本4000r/min离心，取沉淀作涂片二张，分别进行萋-纳氏抗酸染色和潘本汉染色，在两张涂片上镜检均发现有红色杆菌，则可报告“见抗酸杆菌”，如萋-纳氏抗酸染色片上有红色杆菌而潘本汉染色片中无，则为耻垢分枝杆菌。结核分枝杆菌的培养接种罗氏培养基。
注意事项：
1．若G杆菌尿液菌落计数<10/ml可判断为污染，>10/ml可判断为感染，10/ml~10/ml为可疑需重复
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5
4
5
检查。对于G球菌而言尿液菌落计数>10/ml可判断为感染菌。
2．尿路感染一般由单一细菌引起，偶尔也可由一种以上细菌引起。当同一份标本中同时检出三种或三种以上细菌时，标本污染可能性大，需重新留取标本检查。
3．尿液是良好的细菌生长环境，采取后应立即检验，放置时间过长会导致感染菌和杂菌过度生长，影响诊断的准确性。不能及时接种的标本可临时存放4℃冰箱，但不得超过2h。
4．菌落计数的影响因素较多，与抗生素的使用、输液、使用利尿剂、尿液的pH变化和细菌种类有关。 5．尿液标本中不得加入防腐剂和消毒剂。
6．为了避免变形杆菌迁徙生长而污染其它标本，每个平板只能接种一个尿液标本。也可使用抑制变形杆菌迁徙生长的培养基如麦康凯等。
+4
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纸片扩散法（K-B法）： 原理：
药敏纸片是一种含有一定浓度抗生素的滤纸片，一旦与培养基接触后即可吸收培养基中的水分而使抗生素均匀扩散，形成一种递减的浓度梯度，当培养基上的细菌被这些药物作用后表现出自身特异的敏感性（在纸片周围的细菌生长被抑制而形成透明的抑菌圈）或抗性（在纸片周围的细菌照常生长或抑菌圈很小），根据抑菌圈直径的大小可测定细菌对此种药物的敏感程度。抑菌圈的大小与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
方法：
（1）挑取孵育16~24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准。
（2）无菌棉拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。
（3）平板在室温下干燥3~5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，35℃孵育16~18h，量取抑菌圈直径。
结果判断： 质量控制：
用毫米尺测量药物抑菌圈直径大小，参照判断标准。按照敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。 标准菌株的抑菌圈直径大小应在表2所示的预期值范围内，如果超过该范围，应视为失控，需及时寻找原因，重新进行试验。
影响因素：
培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量和菌龄、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响纸片扩散法抗生素敏感试验结果的准确性和精密度。
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实验八真菌、四体、病毒
一、实验内容（板书）：
I
一、示教：
1、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、回归热螺旋体形态示教片
2、石膏样毛癣菌——菌丝、小分生孢子；石膏样小孢子菌——大分生孢子 3、芽管形成试验——白色念珠菌 4、新隐墨汁染色
5、酵母型菌落——新型隐球菌、类酵母型菌落——白色念珠菌、丝状菌落——石膏样毛癣菌
二、操作：
牙垢涂片镀银染色、G染色镜检
真菌按形态可分为单细胞真菌和多细胞真菌，其中单细胞真菌又可分为酵母型和类酵母型。多细胞真菌又称为丝状菌，由菌丝和孢子组成。单细胞真菌常用格兰染色，特殊情况真菌墨汁负染，多细胞真菌多用乳酸棉兰染色。
酵母菌：多数不致病，对人致病主要为新生隐球菌，常用墨汁负染，可见圆形或卵圆形孢子，外围有宽厚荚膜，荚膜较菌体大1~3倍，折光性强，白色透亮，非致病性隐球菌无荚膜。
类酵母菌：多数不致病，对人类致病为白色假丝酵母菌等。常用格兰染色观察形态，可见G阳性（着色不均匀），圆形或卵圆形（瓜子仁）孢子及假菌丝存在，有时可见厚膜孢子及牙管存在，菌体要比细菌大很多。常规情况下观察到念珠菌即可判断。某些情况下需做一些鉴定试验来确定白念感染。常见试验有芽管形成试验，厚膜形成试验 。本次示教为牙管形成试验。需要注意的是：白念牙管可阳性也可阴性；其它念珠菌一般为阴性，但热带念珠今年6h或更久也可形成牙管。方法：将念珠菌接种到0.2~0.5ML血清中，37度水浴1~4h内镜检观察有无牙管形成，观察时可以革兰染色，也可不染色。
多细胞真菌由菌丝和孢子组成，两者形态因真菌种类不同而异，可作为鉴别真菌的主要依据。菌丝按横隔可分为有隔菌丝和无隔菌丝，或按形态分为球拍状，结节状等形态。孢子按繁殖方式分为有性孢子和无性孢子。对人致病主要为无性孢子。无性孢子分为叶状孢子，（芽生孢子，厚膜孢子，关节孢子），分生孢子（大分生孢子，小分生孢子），孢子囊孢子。今天示教为分生孢子，即大分生孢子和小分生孢子。 小分生孢子（石膏样毛癣菌）：菌丝呈球拍状，孢子呈葡萄状或梨状。单个存在，位于菌丝顶端或侧端。 大分生孢子（石膏样小孢子菌）：菌丝呈球拍状，孢子呈纺锤形，分隔，多个孢子存在。
真菌不仅形态上有差异，同样菌落上也有差异。常用培养基为沙保弱，培养温度为28~37度，根据真菌特性不同，形成菌落也有所不同。单细胞真菌可形成酵母型菌落和类酵母型菌落（假菌丝），多细胞菌落可形成丝状菌落。
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