一、电转化感受态细胞的制备
1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）
2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 二、连接产物纯化
1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10μl of ddH2O
2μl of 3M NaAC（PH5.2）
50μl of 无水乙醇
轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟；
3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；
4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5.4℃，top Speed离心5分钟；
6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用； 三、电转化
1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；
2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。 3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
4.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部； 6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 7．37℃，220－250rpm复苏1小时。
8. 取20μl转化产物加160μlSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。
注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。 四、电击杯清洗流程 1.用清水将电击杯稍冲一下。
2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4.加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。 5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。 注：1．不同样品使用的电机杯应分开； 2．每周用1%酒精浸泡30分钟。
各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态细胞里面的菌体全都死了？是为什么呢？有人有遇到这种情况的吗？还望各位网友多多指教，感激不尽哈！急急急！！！ chenchuan24891(站内联系TA) 你应该自己好好去按文献的方法检查一下，大多数情况下是自己的失误造成的。如果还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。 clx@6016(站内联系TA) 1楼: Originally posted by clx@6016 at 2011-11-21 1134:
各位虫友好，想请教下大肠杆菌电转化方面的一些问题，希望各位虫友多多指教 .最近一直在做电转化，可每次制备的电转化感受态细胞都不行，最开始做的还可以达到10的六次方，可最近两次做的，貌似做好的电转化感受态 ... 先把新鲜划好的菌接到含有Amp的3mlSOB试管中，30度过夜培养，第二天以1:50的接种量转接到50ml含有Amp的SOB中(转接之前加入MgCl2)，30度摇菌2小时，OD600为0.1左右，然后加入L-阿拉伯糖诱导35分钟，OD600为0.3-0.4左右。5000转，4度离心10分钟，收菌。然后用10%甘油重悬3次，5000转，4度离心10分钟。最后将菌体浓缩500到800倍后保存在10%甘油中。然后立刻电转！如果有什么问题，还请各位前辈多多指教哈！
clx@6016(站内联系TA) 3楼: Originally posted by chenchuan24891 at 2011-11-27 0956:
你应该自己好好去按文献的方法检查一下，大多数情况下是自己的失误造成的。如果还是这样的话，请你把你做的步骤给大家看一下。 恩，谢谢哈！ dnaxxx(站内联系TA) 电转的话应该按照电转仪的说明来制备感受态吧，我们买的仪器有很多菌的protocol和建议电转条件
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
发布时间：2011年03月07日 点击次数：：次
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的
作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/μg DNA。
3.1．感受态细胞的制备
（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。 （2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。 （4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化
为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。 （1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。特别注意，不同的电转化
杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。