（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 （5）重复第4步操作。
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 （7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。 本法效率极高,建议大家采纳 方法四
1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min 3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 方法五
E.coli感受态细胞制备方法:
单菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600=0.2-0.4 离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.
转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42℃ 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml, 37℃ 1小时后铺抗生素平板。 TSS:
7.0ml pH6.1 LB 2.0ml 50% PEG6000 0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 0.3ml ddH2O
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化
以枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）为例 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
1.准备新鲜的168单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37?C培养箱培养12 h；
2.转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB培养基中，37?C，250 r/min培养过夜； 3.第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37?C，250 r/min培养至对数生长末期(168约4-5 h)；
4.取0.2 ml生长至对数期末的培养液至2 ml SPII培养基中，37 ?C，100 r/min培养90分钟；
5.在上述SPII培养基的菌体中加入20 ?l 10mmol/L EGTA，再于37?C，100 r/min培养10分钟；
6.将上述处理后的菌液分装成0.5 ml每管，各加入5 ?l DNA（DNA量不能过高，不超过5?g），再于37 ?C，250 r/min培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。
相关试剂配方如下： SP盐：
0.2%( NH4 )2SO4, 1.4% K2HPO4, 0.6% KH2PO4, 0.02% MgSO4?7H2O, 0.1% 柠檬酸钠;
CAYE (100?)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。
SPI培养基： SP盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100?CAYE溶液； SPII培养基：SPI培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2溶液。
? 试剂
SP－A Salts Solution：（500 ml Solution）
0.4％ (NH4)2SO4 2g 2.8% K2HPO4?3H2O 14g
1.2% KH2PO4 6g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g 121℃灭菌20min
SP－B Salts Solution：（500 ml Solution）
0.04% MgSO4?7H2O 0.2g 121℃灭菌20min
100× CAYE Solution：（100 ml Solution）
2％ Casamino acid 2g 10％ Yeast Extract 10g 121℃灭菌20min
SPI Medium：（20 mL）
9.8mL SP－A Salts Solution 9.8mL SP－B Salts Solution
200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min） 200µL （1％V）100× CAYE
SPII Medium：（6 mL） 5.88mL SPI Medium
60µL （1％V）50mM CaCl2 60µL （1％V）250mM MgCl2
100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 注意：
1. 注意仪器用品的干净和无菌；
2. 8ml SPI培养基要放于50ml离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用玻璃试管；
3. 注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期； 4. 保证菌体的浓度，可以提高转化率。
感受态制备关键点
1.甘油的质量，水的质量，最好是miniQ的，如果要求完美，洗瓶不要有洗涤剂残留，先将瓶装满miniQ水高压，再弃去，再配置10%甘油。收菌以半对数期合适，一般OD 0.5收菌，过则不佳，直接取-80度菌种摇，次日转种，从盘上菌落摇的要差，33-34℃摇菌结果更理想。在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗涤时一定低温，重悬时应轻震荡，弃洗涤液应
倒干静，那怕损掉部分细菌。最后大概500ml能做3-4ml感受态，液氮中冻10min转-80度冰箱，快一点，免的EP管爆了，也可不冷冻，直接用来转化。感受态应以标准浓度质粒电转记算效率，一般大于109/mg，操做以1ng/ul质粒1ul加40ul感受态置0.1杯，电转后以最快的速度加入1ml SOC复活，100-150转摇1hl，取1/1000铺盘应大于1000个菌生长。这样用于建库工作才行。电转时质粒或连接物尽可能少，以减少离子，实际上离子高，电流直接通过，没有场强，质粒是进不去的。 注：
1.任和有关东西都要干净，保证没有离子， 2.从接触甘油开始就保持恒温，0℃， 3.电击后复活要快。
关于载体连接的讨论
相信凡是做过分子生物学的人应该都对载体构建有所了解，而载体构建中基因片段同载体的连接是一个关键所在，现就同载体连接相关内容讨论如下：
1.连接的反应温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，分子布朗运动速度过快，连接后末端的氢键结合变的很不稳定，致使刚连接后的片段又大量的解离，所以连接反应不能在过高的温度中进行；但是，随着温度的降低，连接酶的活性降低，故为保证连接的效率，采取折衷方法是16℃过夜，这样能够保证获得最佳的连接效果。当然，也不是所有的连接反应都是在16℃下最好，也可以采用12℃过夜，或者37℃下反应30min然后4℃过夜等等，这需要根据实际情况调整；
2.限制性内切酶在反应中是不需要外部提供能量的，但是T4 DNA连接酶需要在外部提供能量的情况下才能完成连接反应，因此，能量ATP的充分供给将是连接反应成败的另一关键因素。对于商业化的DNA连接酶来说，一般ATP都是在提供缓冲buffer中的，而ATP是不稳定的，随着时间的延长，ATP会大量的消耗，为了解决能量即ATP的问题，建议对于难以连接的片段，不妨采用下面的方法试试：先以正常的体系连接（10μl体系中含1μl 酶、1μbuffer、片段、载体）（16℃）连接4-6h，然后在该体系中再加入1μl buffer以提供充足的ATP，而此时可以不用考虑反应体系中盐离子浓度等，因为此时能量是更为重要的问题。
当然，连接反应还有其他许多因素，比如载体和片段的比例、片段末端形态等等这些都在此暂不讨论，只提供以上两点供参考。
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