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Lofeel 2008.3.25
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 来源：小木虫论坛 2006-11-21 23:33:00 访问量：8229 评论（0）分享 这都是我几年来经验总结啊,觉得有用一定要顶 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 方法一 [试剂准备]
A液： 1M ， MnCl2：
B液： 1M ， HEPES ， pH=6.2-6.8 ，用无菌水配，配后不需灭菌； C液称取 CaCl2 0.10g ， KCl 1.18g ，全部转入细口试剂瓶，然后加入 46ml 三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅 121 ℃高压灭菌备用。 [操作方法]
1. 取 1 管 B 液（ 0.6ml ），全部加入 C 液 (46ml) 中，混匀后，再用 1ml 移液器加入 3.3ml A 液，混匀冰浴即可使用。
2. 划线得到单菌落，37 ℃培养箱培养约 17 小时，挑取 2-4 个形态饱满的单菌落接种于装有 100ml SOB 培养基的三角瓶 ,37 ℃剧烈振荡（ 300 rpms ）培养 3-4 小时，将培养温度调至 18℃剧烈振荡（ 3280 rpms ）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入 4ml TB 缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入 280ml DMSO （可用国产分析纯），混匀后分装入 1.5ml EP 管，冰上静置 15 分钟。用纱布将所有装有感受态的 EP 管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置 12 小时以上。取出感受态放入 -70℃超低温冰箱备用。 此法效率非常高，一般可到 108，好时可到 109，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将 LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP 管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到 1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于 1990 年《gene》上刊登的由 Inoue H. 等提出的高效感受态的制备与转化方法。 [注意事项]
1 、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。离心力要注意不要超过 2500g，建议 1500-2000g 5min 。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴 2 小时以上的板。涂完后建议空气晾干（ 20-30 分钟）这样会减少卫星菌落出现。
2. 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置 1min ，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液。
3. 培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积 / 三角瓶容量 =100ml/500ml ， 50ml/250ml 。
4. 培养基的 pH 值。这是讲的 pH 值并非单指配置或灭菌后的 pH 值，而且还包括整个摇瓶结束后的 pH 值。一般来说，接种前的 pH 值在 6.8-7.2 ，等菌摇好后，可以测一下 pH 值，不要低于 6.0 ，最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
5. 培养后的 OD 值。其实这并一个非常重要的参数，只是当 OD 值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调 OD 不得大于 0.6， 0.8 等等。同时， OD 值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在 OD 值的两方面影响中找一个平衡点。
6. 培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的 Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用 20mM MgCl2 做为培养基的添加物，在感受态收获之前 20-30 分钟加入，会收到很好的效果。 7. 培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
8. 此外文献报道，在保存感受态时， DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
9. 液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。 方法二
1. 液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌 *E.COLI DH5，JM109，HB101 等，在 LB 平板上划线，37 度过夜至长出单菌落。
2. 挑直径 1-3 毫米的单菌落 * 可多个，接种到 250 毫升 /3 升锥形瓶或 80 毫升 /1 升锥形瓶的 SOB 培养基，培养基量不可再多, 会影响效率。 3. 在 18 度 150-250RPM 培养 19-50 小时 * 没有冷却摇床的可在室温 , 但不可高于 37 度 .
4. OD600 约 0.4-0.8 时停止培养，放在冰水中冷却 10 分钟
5. 4 度，300RPM 离心