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于缺乏相应的基础研究支持，使得这些措施针对性不强，临床效果不明显，这种由药物自身因素引起的静脉炎并未得到改善。
近年来有关静脉炎的基础研究主要是针对抗生素类药物的。目前国内外资料尚缺乏对化疗药物，特别是长春碱类化疗药物所致静脉炎的基础研究，化疗药物所致静脉炎的基础研究也仅局限于动物病理学水平，深入的机制研究鲜见报道，由此可见，深入研究药物静脉炎发病机制的需求非常迫切，在此基础上寻找临床上更为特异和有效的预防或治疗药物，对提高合理用药水平，减少药源性疾病损害，改善患者的生活质量具有重要的理论和实际意义。
国外学者研究[31-32]表明血管内皮细胞在一定浓度的高细胞毒性的抗生素的刺激下，细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)等黏附分子的表达增高，而这些细胞间相互作用相关的细胞表面标记物的表达，可能是药物性静脉炎重要的发生机制。那么临床常见的长春瑞滨所致的静脉炎中是否也存在这些细胞因子的表达变化？亦或存在其他炎症相关细胞因子的表达呢？
Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁[33]。被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白[34]。
哺乳动物中已发现至少13种TLR和一系列TLR配体，其中人TLR为TLR1～10，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。免疫细胞通过其表面的Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)识别病原微生物启动天然免疫反应。各种不同的病原体，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒和衣原体均可以被TLRs识别。在天然免疫过程中，TLRs捕获病原体上相应配体，启动细胞内信号途径，导致一系列酶的激活、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径活化及炎症因子的释放。
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TLR4在该受体家族中最早被发现，定位于人染色体9q32-q33上，组织分布较广泛，见于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、人齿龈成纤维细胞、人子宫颈平滑肌细胞、大鼠脾和心肌细胞等，主要功能是作为脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的信号转导受体，在宿主的防御反应中发挥重要作用[35-36]。
TLR4主要识别革兰阴性菌成份LPS，LPS通过激活宿主细胞膜上的CD14和TLR4受体，进一步活化NF-кB，使单核和巨噬细胞产生IL-21、6、8和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)，趋化炎性细胞浸润，诱发炎症，刺激树突状细胞成熟，启动先天和后天免疫。研究表明，TLR4不仅通过识别革兰氏阴性菌的LPS 启动细胞内信号转导，同时也识别结核分枝杆菌、烟曲菌、新型隐球菌和白色念珠菌等其他微生物的病原相关分子模式[37]。大量研究已证实TLR4在败血症、脓毒症、肠炎、阑尾炎、胰腺炎等感染性炎症反应中都发挥了重要作用。
越来越多的证据显示，即使没有感染存在，内源性配体也可以刺激TLR4并引发免疫反应[38]。为区别微生物来源的外源性分子(如LPS等)，将其命名为TLRs的内源性配体。目前发现TLR4可以识别多种内源性配体，如透明质酸、硫酸肝素、纤维蛋白素原、高迁移率族蛋白1和热休克蛋白等。研究发现除了外源性配体以外, 内源性分子，比如热休克蛋白60(HSP60)、纤维结合素、纤维蛋白原和透明质烷低聚糖也能够通过TLR4诱导促炎细胞因子的产生[39]。另一项研究也表明，某些创伤和手术等引起的全身炎症反应综合症和远离组织器官损伤时，循环中并未检测到细菌和内毒素，而应用TLR4阻断剂可明显减轻炎症反应和组织损伤，因此可能不是内毒素，而是内源性配体激活了TLR4[40]。机体受到刺激时，体内某些内源性分子能从激活的免疫细胞、肠上皮细胞主动分泌或者从坏死或损伤的细胞中被动释放出来。这些内源性分子可被TLR4识别并结合，进一步诱导单核-巨噬细胞系统及树突状细胞的活化和成熟，促进炎症因子的释放[41]。以上研究均表明TLR4在非感染
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性免疫炎症反应中也发挥了重要作用。
虽然迄今尚无TLR4参与药物性静脉炎形成的相关报道，目前也尚不知道TLR4是否参加了VIN引发组织损伤的信号转导。但是基于药物性静脉炎的本质是由于药物对血管内皮细胞的刺激而引起的一种化学性炎症反应，而TLR4不仅可启动机体抗感染性免疫炎症反应，它还在非感染性免疫炎症反应的介导和信号转导中发挥重要作用[42-46]。我们提出如下设想：TLR4在长春瑞滨致静脉炎过程中发挥着重要作用。长春瑞滨致静脉炎的可能机制是：长春瑞滨刺激血管内皮细胞膜上的TLR4受体后，导致NF-κB信号转导途经被激活，内皮细胞被活化；活化的内皮细胞与其配体结合，从而与白细胞黏附，导致内皮损伤和白细胞渗出，激发炎症过程，并继而通过一系列反应激活血小板聚集与血栓形成过程。
为验证上述假设，本研究拟选择临床反应强烈、具有一定代表性的长春碱类药物长春瑞滨为研究对象，通过体内体外实验观察VIN对小鼠尾静脉血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞(Human umbilical venous endothelial cells，HUVEC) TLR4表达及下游NF-κB活化的影响，初步探讨TLR4在VIN损伤血管中的作用。
本课题采用动物组织病理学及细胞形态学明确长春瑞滨对血管内皮细胞的损伤作用；分别采用动物和细胞的免疫组织化学、荧光定量PCR 、Western-blot分析明确TLR4基因及蛋白表达受长春瑞滨刺激的变化规律；采用免疫荧光染色法考察考察长春瑞滨致静脉炎的过程对NF-κB活化的影响。本研究不仅有助于认识TLR4与长春瑞滨致静脉炎发生的相关性，也有助于深入了解药物性静脉炎的发生机制，而对于这一机制的认识，将会为该类静脉炎的防治提供新的基础理论依据，可能为今后临床治疗静脉炎提供新的途径与思路。
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第一部分
Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义
材料和方法
1 材料
1.1 主要试剂
长春瑞滨
兔抗小鼠TLR4多克隆抗体 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗 DAB显色试剂盒 多聚甲醛 1.2 主要仪器
倒置显微镜（IX71） 病理组织包埋机 病理组织漂烘仪 电子pH计
电子天平（Mettler AT261） 石蜡切片机（RM2235） 微量移液器 1.3 实验动物
Sigma公司 Bioworld公司
北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司
国药化学试剂有限公司
OLYMPUS公司
常州市中威电子仪器有限公司 常州市中威电子仪器有限公司
瑞士Mettler公司 瑞士Mettler公司
Leica公司
京君龙实验仪器有限公司
雄性清洁级BALB/c小鼠，7～8周龄，体重为24～29g，购自扬州大学，动物许
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可证号：SCXK(苏) 2007-0001，饲养于徐州医学院实验动物中心。 1.4 主要试剂的配制
1.4.1 PBS（0.01mol/L）缓冲液：
NaCl KCl NaH2PO4 K2HPO4 8.00g 0.20g 1.44g 0.24g 800ml双蒸水溶解，1mol/L盐酸调节溶液的pH至7.4，双蒸水定容至1L，高压灭菌后室温保存（注意：高压灭菌后用灭菌双蒸水补充定容）。 1.4.2 4%多聚甲醛溶液：
称取40g多聚甲醛，加至800ml 双蒸水中，滴加适量0.1M NaOH溶液促进多聚甲醛溶解，搅拌混匀，待多聚甲醛完全溶解后，加100ml PBS（0.1mol/L），双蒸水定容至1L，浓盐酸调pH至7.30~7.40，0.45μm滤膜过滤，4℃保存备用。
1.4.3 0.5 mol/L EDTA：
量取90 mL双蒸水，加入20gEDTA，用NaOH调节PH至8.0，磁力搅拌溶解，用1 mol/L HCL调节PH至7.3-7.5，定容至100 mL，过滤除菌，室温保存。 1.4.4 清洁液配制
重铬酸钾 浓硫酸 蒸馏水 120g 200ml 1000 ml 应于陶瓷容器中配制，配制时先将重铬酸钾完全溶解于蒸馏水中，然后缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅拌以助散热。 2 方法
2.1 实验分组及干预
参考黄吉春[26]等的造模方法实施预实验，结果显示3.2 g/L长春瑞滨注射后
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