【2】你的上样量是多少呀？如果胶上没有条带最大的可能就是上样量不够。蛋白浓度是多少？最好都测一下，因为最大的可能就是蛋白的浓度不够。
【3】蛋白放置过久，裂解液没有放蛋白酶抑制剂都会导致蛋白浓度不够。
【4】如果用的细胞的话，细胞浓度过小，提取细胞时没有提取好都会导致蛋白浓度过小。
【32】sigma的HA抗体，现在做WB杂带不少，背景也很深，请教达人们：如何摸索一抗二抗的稀释倍数呢？
答：【1】抗体的说明上，都给出了一个范围，可以以这个范围为根据摸索。开始的时候可以把膜剪成几小块，每一块用不同的一抗二抗浓度，这样就可以比较快的摸出适宜的浓度。有些时候也有一定的经验的：我用的是SANTA CRUZ的抗体，一抗建议的稀释比是1：200－1000，我用的是1：400效果挺好的。周围的人用的这个公司的其他一抗也是建议这个稀释比，他们也是稀释成了1：400，效果也挺好的。所以，如果用的是这个公司的一抗，如果建议的稀释比和上面相同的话，建议先用1：400试一下。
【2】如果背景深，考虑二抗浓度高了，可以降低二抗浓度。当然没封闭好等很多其他原因也可以引起背景过高。
【3】如果杂带较多，可以考虑降低一抗的浓度。如果没有条带，则可以考虑增加一抗的浓度。
【4】当然，在摸索抗体浓度的同时，要保证其他步骤的完善、合理性：转膜成功、封闭的要好、上样量是否合理（不要太大了）等。
【33】今天用新买的抗体做了一下WB 我的蛋白是33KD 具体步骤如下，电泳80V 30分钟,120V 60分钟 转膜 湿转 0.2A 1 小时
封闭 37度 2小时 5%脱脂奶粉
一抗 Sant cruz的抗体 建议范围是1;200----1:1000 我用的是1：400的稀释 室温摇床上3小时 4度过夜
TBST 洗涤 10分钟X3次
二抗 建议的范围是1：200---500 我用的是1：350 37度3小时 TBST 洗涤 10分钟X3次
发光液刚加上去，在暗室里就看到膜上是一片荧光啊 根本不敢曝光了
不知问题处在哪里了 我自己怀疑是二抗的浓度太高了，也可能是二抗孵育过后洗涤膜的时候没有洗干净，可是可能性不大，要是没洗干净不会整块膜上都是荧光的吧，打算明天点膜试试看 请高手指教！！
答：【1】转膜应该没问题吧？膜上能保证有蛋白条带吧？
【2】建议延长封闭时间，可以室温4小时，奶粉一定要溶好，要完全溶解，没有沉淀。 【3】一抗一般4度过夜就可以了，不是越长越好。一抗最好用5％的脱脂奶粉稀释。 【4】减少二抗孵育的时间，一般室温1小时就可以了。37度的话，一般30分钟就可以了。适当降低二抗的浓度。
【5】你的二抗是进口分装的，不知道是分装的什么公司的。我的二抗是Sant cruz公司的，它建议的范围是：1：2000－100000（1：2千到10万），范围的跨度比较大。建议你可以把膜剪开，剪成几段，然后用不同的二抗稀释浓度，摸一下二抗的适宜浓度。建议用1：500。1：1000，1：2000都试一下。
【6】TBST 洗涤时用的器具要干净。这一点也挺重要的。
【7】减少上样量或者降低蛋白浓度，这也是挺重要的一步。不知道你的上样量和蛋白浓度时多少。
【34】我用的是Bio-rad的垂直电泳仪，短玻璃板约7cm高，8cm宽，我的梳子是12齿的，做出的孔，最多加25ul的样，如果我用中瓶养细胞，长满了就收，几瓶细胞裂出的蛋白，才够一个上样孔用的呀？25ul里要含多少蛋白才合适？ 答：【1】这要看你养细胞的水平和提取细胞的水平。
【2】我用的是50毫升的培养瓶（中等的培养瓶），我先把细胞用消化液消化下来，用PBS清洗，离心后倒掉上清液，然后我加入50微升的裂解液，提出大约60微升左右的蛋白（因为清除上清液的时候，会有少量液体的残留，所以加上50微升的裂解液共60微升左右）。我测了一下浓度，大约在3－4微克/微升（毫克/毫升）。我每孔上样20微升，一般能用三次左右（就是说一瓶的细胞够用3次，也就是说一瓶提取的蛋白可以放到3个孔里）。不过我培养瓶内的细胞密度一般比较大，我是用消化液提取的细胞，比用细胞刮子提取的细胞要多。一般提蛋白的话，可能要小于我的。
【3】一般每孔上样量（你的是25微升）要含蛋白20－30微克就可以了。如果提取的蛋白含的目的蛋白较少的话，可以含蛋白100微克。也就是说可以含蛋白20－100微克。根据你的具体情况定。
【35】我用的是Santa Cruz的抗体，用2％的BSA封闭，一抗1：500用含1％BSA的TBST稀释，二抗1：2000用含1％BSA的TBST稀释，结果什么都没有？请问各位高手怎么办? 答：既然你以前做出来过，整体上应该是没有问题了，估计问题出在细节上了。
【1】什么东西都有一个度，不是越长越好的。一抗4度过夜已经足够了，没有必要再室温一小时的。
【2】我以前也出现过你的这种情况。哈，荧光条带比较明显（但不是很漂亮），但曝光总是马马虎虎的。后来的改进方法其实说出来挺可笑的。就是封闭用的，TBST洗用的器具（我用的是培养皿）都要非常认真的清洗，而且每次都要换新的（清洗过没用过的）培养皿。曝光用的桌子，保鲜膜都保持很干净。枪头都是高压过的。总之，从转膜完成后的膜接触过的东西，都要保持干净，应该说是非常的干净的。所以我的培养皿是非常多的，用完了，就用洗涤精洗干净，然后用自来水冲干净，放入恒温干燥箱内。如果用TBST冲洗的话，先用TBST冲洗一遍，然后再用。感觉这一点很重要。还有就是不要把包有膜的保鲜膜放到金属器具（比如金属桌子）上，金属会导致荧光淬灭的。
【3】抗体的浓度要摸一下，这也挺重要的。一般进口的一抗，如果建议稀释比例是1：200－1000的话，一般用1：400差不多，效果一般挺好的。
【4】如果放入ECL 中没有荧光可以适当然长在里面的时间，有时候过一会就可能看到荧光了。放置的时间较长的话，即使出来荧光，曝光的话，也挺难出现非常漂亮的条带。但是这可以告诉我们，做法是对的，适当提高一抗的浓度或者增加蛋白浓度一般会有较好的效果。
【36】我用的是Santa Cruz的抗体，用2％的BSA封闭，一抗1：500用含1％BSA的TBST稀释，二抗1：2000用含1％BSA的TBST稀释，结果什么都没有？请问各位高手怎么办? 答：既然你以前做出来过，整体上应该是没有问题了，估计问题出在细节上了。
【1】什么东西都有一个度，不是越长越好的。一抗4度过夜已经足够了，没有必要再室温一小时的。
【2】我以前也出现过你的这种情况。哈，荧光条带比较明显（但不是很漂亮），但曝光总是马马虎虎的。后来的改进方法其实说出来挺可笑的。就是封闭用的，TBST洗用的器具（我用的是培养皿）都要非常认真的清洗，而且每次都要换新的（清洗过没用过的）培养皿。曝光用的桌子，保鲜膜都保持很干净。枪头都是高压过的。总之，从转膜完成后的膜接触过的东西，都要保持干净，应该说是非常的干净的。所以我的培养皿是非常多的，用完了，就用洗涤精洗干净，然后用自来水冲干净，放入恒温干燥箱内。如果用TBST冲洗的话，先用TBST冲洗一遍，然后再用。感觉这一点很重要。还有就是不要把包有膜的保鲜膜放到金属器具（比如金属桌子）上，金属会导致荧光淬灭的。
【3】抗体的浓度要摸一下，这也挺重要的。一般进口的一抗，如果建议稀释比例是1：200－1000的话，一般用1：400差不多，效果一般挺好的。
【4】如果放入ECL 中没有荧光可以适当然长在里面的时间，有时候过一会就可能看到荧光了。放置的时间较长的话，即使出来荧光，曝光的话，也挺难出现非常漂亮的条带。但是这可以告诉
我们，做法是对的，适当提高一抗的浓度或者增加蛋白浓度一般会有较好的效果。
【37】我用0441的marker,湿转，2个小时，电压100伏，正负极没有放反，没有短路，电转液也试着更换新配的，但是就是转不上去。愁死了！！！！2个小时后，marker还在胶上，就跟没转似的，我要疯了！！！！！求有经验的指导啊！！！！ 答：这样的情况不多，一般不会一点也转不过去的。
【1】转移的时候有放冰袋或者冰降温吗？如果没有，转移完后，转移液应该是有比较明显的温度升高，即使放了冰袋或者冰，转完后电转液的温度也会有一定的升高（可以用手摸一下转移液，很容易摸出是否有温度的升高），如果转完后没有温度升高（和初始的转移液温度相同），说明根本就没有有效的转移。可能是转移槽的盖子没盖紧，电源没接上，转移槽支架上的金属丝断了，或者某个地方的电线接触不好。请注意这一点，感觉转移完成后，转移液的温度并没有升高的可能性比较大，如果这样，转不过去的原因就如上述。感觉问题在此点的可能性比较大。 【2】电转液（转移液）是怎么配制的？我用的是如下配方，尽管配方并不都是相同的，但应该还是差不多的，看一下，是不是电转液有问题。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇） 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
上面是1×的，配制时可以配成10×的，然后应用时再稀释成1×的。 【3】转膜一般还是用衡流好一些，所以最好不要用衡压，而用衡流。
【4】即使胶和膜的位置放反了，或者夹膜的夹子黑面和白面放反了，胶上的蛋白也会转走的，转不到膜上，也会转到其他地方的，而不会在胶上的。
【38】做WB几个月了，一直不成功，很郁闷，请各位战友帮忙分析一下问题出在哪了，先在这里谢过！！
我做的目的蛋白有两个，分子量分别为28KD和57KD，内参是action，分子量42KD，使用蓝色预染蛋白Marker，跑胶结束后可以看到Marker条带，基本与说明书上的图示吻合，用考蓝G250染色，可以看到Marker以及蛋白样本的条带。
重新跑胶后转膜，半干转0.65mA/cm2，2小时，可以看到PVDF膜上的Marker条带，不是很清晰（个人考虑与上样量有关，5微升），丽春红染色未见条带，封闭2小时，一抗（1：500）孵育，室温2小时或更长时间，洗膜3次，每次10分钟，同法二抗（1：1000）孵育、洗膜后显影。
压片5分钟到30分钟都用过，暗室中看不到条带荧光，显影、定影后也是白板一块，没有一点痕迹。
（用孵育后的二抗稀释液和发光液直接反应可以看到荧光，觉得可以排除发光液和二抗的问题。） 请各位战友帮我分析一下问题在哪儿，感激不尽！！！
答：【1】ECL的灵敏度远大于丽春红，所以丽春红染色染不出，曝光的时候同样可能曝出来的。 大家说丽春红的敏感性比较低，所以现在已经不做丽春红了，但是曝光还是一片白板，说明前面肯定有比较关键的错误
答：一般做的比较熟练的，或者做的比较成功的这一步可以不做的。象这么长时间结果还没出来，这一步最好做一下。你可以上样时多加几个孔，转膜完成后把这几个孔用剪刀剪下来，去丽春红染色。其他的继续做。
【2】转膜是挺重要的一步，膜先要用甲醇泡，然后用转移液泡。可以先测量一下蛋白浓度，看蛋白浓度是不是合适。
我用的PVDF膜，每次用100%甲醇浸泡10-15分钟，然后转膜液浸泡10-20分钟，是否达到要求？蛋白浓度1-2微克/微升，上样量25微升（胶厚0.75mm，只能上这么多了），上样量是否够？
答：甲醇一般不用泡那么长时间的。一般来说是15秒－20分钟的时间，只要泡透就行了，在甲醇里，膜一般是很容易透的。我都是泡1－2分钟。然后放入转移液，我在转移液中放的时间是比较长的，一般泡1－2小时，就是早早的就把滤纸，海绵，膜等物质放入里面。
上样量一般来说20－30微克就可以了。如果目的蛋白低表达的话，可以把上样量加到100微克。你的是什么蛋白？组织还是细胞？蛋白浓度怎么这么小呀？你最好还是提高一下蛋白浓度。 【3】一般MARKER 要看的很清楚是比较难的。但是仔细辨认应该还是应该能看到的。 Marker每次都比较模糊，有时候条带不全，不知道是转过还是没有转够？
答：预染的MARKER一般来说，所有的条带都很清楚的转到膜上挺难的，但是有一些条带还是应该比较清楚的。其他条带仔细辨认一般也能看的清楚的。
【39】各位前辈请给我指示指示，我在做western blot ,5*电泳缓冲液没了，各位师兄师姐又不在，我就按下面比例配了，但不知道 合适不？tris 15.1g, gly94g, sds5g,加去离子水至1000ml,混匀。用时取了200ml,加去离子水调至终浓度1000ml。还有个问题，为什么电泳液使用时要配成1*的？往蛋白里加的loading buffer终浓度也要调至1*？