答：【1】所谓的1×就是说是应用时应该应用的浓度。所以应用的时候，都应该配成1×的。 【2】配成5×或10×就是为了方便，免得每次都要配的麻烦。
【3】下面是1×电泳液的配制方法，你的是5*的。正好是5倍的关系，你的配方是正确的。 电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77g SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
【40】版上精华区、归档区的帖子我也都看过了。对于western显色荧光淬灭的解释都是蛋白浓度、一抗或者二抗浓度过高的缘故。我也曾试过我二抗浓度降到推荐的最低，可是还是不行。下面我把我的具体情况给大家说一下，希望同仁们多多帮助，不吝赐教！
我是提取细胞裂解液上样，最初的时候因为要检测的蛋白表达量低所以上样60ug，用的的PIERCE的荧光显色，开始1：2000稀释二抗，显色结果很好，荧光也非常亮，非常持久，stripping 3次以后还是能得到持久的荧光显色。但是不知道从什么时候开始，莫明的就出现了荧光很快淬灭的现象。就是加上显色底物以后，荧光就迟也在2分钟内消失。我在版上和PIERCE的说明书上仔细的学习过了，都是说二抗的浓度高，后来我就把二抗降到说明书推荐的1：5000,在暗室中观察加上显色底物荧光非常暗，但还是会很快消失。后来我又把上样时的蛋白总量减半但还是不能解决问题。 我的问题有这么几个：
1. 以前1：2000的二抗浓度，荧光有量又持久，而现在二抗降的再低都不行，这是为什么呢？ 2. 荧光消失以后再补加显色底物，荧光亮一下，消失的更快，而且把底片在膜上一压，荧光就马上淬灭，这又是为什么呢？
3. 我还发现如果一张膜杂一个抗体时淬灭，stripping后杂别的抗体都会淬灭
现在都快疯了，和以前做实验的步骤方法都没有差别，但现在一曝光就淬灭，恳求大家帮帮忙啊！！ 答：很多情况都会导致荧光淬灭，可能每个人的情况并不相同。
【1】用保鲜膜包好的带荧光的膜，千万不要放到金属表面，碰到金属表面，荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的，所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些战友提到用镊子碰到膜会导致荧光淬灭，可能是因为镊子是金属的缘故。
【2】不注意的时候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也会导致荧光淬灭。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。
【3】荧光可能对一些物质敏感，导致荧光淬灭。所以，尽量使和荧光接触的物品都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜，然后曝光，但是保鲜膜太薄，容易卷起来，我就用较厚的塑料袋，但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭，我估计可能是因为后塑料袋上不干净，有些导致淬灭的物
质。后来继续应用保鲜膜，就没有出现类似情况了。
【4】荧光淬灭和蛋白抗体等也有原因。我以前就碰到过，我的是5个条带，发生淬灭的时候，有快有慢，不是5个条带一起淬灭。尽管后来都淬灭了。所以，估计和蛋白抗体等也有关系，但可能并不是主要的原因。
【41】我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的 抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？ 另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。
如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。 答：【1】的确有的一抗可以反复应用很多次的，有的用几次就不好用了。主要跟抗体的特性、质量等有关，跟储存等情况也有关。所以，一种一抗稀释液用多长时间，一般只有用了才知道。 【2】当然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀释液放到里面。然后用封膜机把口封上。这样一抗稀释液就可以把膜全包上了。
【3】二抗也可以这样用，也是很省的，不用重复应用的。
【42】求助各位战友，转膜完用丽舂红染色有条带，但是一抗二抗孵育后ECL显影照相没条带，急
答：【1】目的条带没出来，首先确定样品里有没有这种蛋白，含量如何？ 【2】可以加大上样量，或/并提高蛋白浓度。
【3】蛋白不要放太长的时间，防止蛋白降解。（提取蛋白时，裂解蛋白时不要忘了放蛋白酶抑制剂）
【4】加大一抗的浓度，就是降低稀释比例。 【5】增加一抗的孵育时间。
【6】（曝光后白板一张，不存在背景过强的问题），可以增加二抗的浓度，增加二抗的孵育时间。
【7】可以增加膜放在ECL中的时间。增加曝光时间。
【8】另外注意二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光的可能。前面的方法都用了，还不行的话，就要注意这一点了。可以降低二抗浓度，或者更换二抗
【43】最近打算做ECL发光(以前用DAB显色),但是没见过师兄师姐用过,关于显影定影问题,有很多都不懂,望各位老师帮帮忙.
1.据说显影定影液要避光低温保存,是不是避光后(铝箔纸包住瓶子)放4度冰箱,还是室温就可以?(现在天气开始转热了,不知道室温是否可以)
2.产品说明书上说显影液约1个月可能就失效,定影液大概是2个月.请问我一次大概配多少mL溶液比较好?(我买的是粉剂,直接加水就可以用).是不是只要显影液定影液能浸泡过胶片就可以? 3.盛装显影液和定影液的容器有没有特殊要求?我打算用普通的玻璃瓶装,外面包一层铝箔纸,可以吗?
4.请问整个实验过程大概要用几升的显影定影液?我买了显影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道够不够用?如果是两个月内天天做,大概要用多少? 过几天就要开始做显影定影了,麻烦各位老师帮帮忙,非常感谢
答：1.据说显影定影液要避光低温保存,是不是避光后(铝箔纸包住瓶子)放4度冰箱,还是室温就可以?(现在天气开始转热了,不知道室温是否可以)
【1】放室温可以的，当然，放在4度冰箱就更好了。用铝箔纸包住当然可以，其实用那种有颜色（棕色）的玻璃瓶装也可以的。
2.产品说明书上说显影液约1个月可能就失效,定影液大概是2个月.请问我一次大概配多少mL溶液比较好?(我买的是粉剂,直接加水就可以用).是不是只要显影液定影液能浸泡过胶片就可以? 【2】你说的很对，就是能把胶片淹没就好了，所以要看你胶片的大小和盛放胶片的容器的大小。我显影和定影液各自配了500毫升。显影液和定影液用久了，曝光的效果就不好了，逐渐混浊，有杂质。所以，最好用一个月就换一下。
3.盛装显影液和定影液的容器有没有特殊要求?我打算用普通的玻璃瓶装,外面包一层铝箔纸,可以吗?
【3】没有特殊要求，你说的完全可以。当然，前面已经说了。可以用带染色的玻璃瓶（起避光的作用）装。
4.请问整个实验过程大概要用几升的显影定影液?我买了显影定影粉各一包(各可以配成一升溶液),不知道够不够用?如果是两个月内天天做,大概要用多少?
【4】哈，这要看你胶片的大小和盛放胶片的盒子的大小。如果放500毫升液体就能把胶片淹没的话，如果两个月做完的话，正好够用。
【44】各位大虾，本人现在做一低分子6.5KDa大小的蛋白，其有复合物25KDa（二硫键结合）。复合物本人使用非还原loding buffer已经做出了，证明抗体应该没有问题。
而6.5KDa的蛋白，我使用tricine系统，还原的loding buffer，且加热了。用浓缩胶4％，分离胶10％＋16％的方法，0.2um的PVDF膜，转膜为湿转，30V，60min，70min，80min都试过，预染Marker最小为10KDa，膜上出现了，胶上还剩下一点。但是敷育抗体后没有做出。仪器为Bio Rad 的1.5 cm的mini胶。
请各位指导一下到底是什么，不胜感激！
答：分子量有些小，不太容易出结果。最好每一步都做的更加仔细、更加到位。
【1】分子量小，电泳的时候不要时间太长。下面的兰色跑到胶的1/3左右一般就可以了。跑的久了，小分子量的蛋白很容易跑散了。
【2】如果没有把握，可以一步一步来。先用考马斯兰染一下胶，证明胶上有。然后可以用丽春红染色（这步熟了以后最好不要做，因为这会对以后的结果有影响。）。 【3】转膜还是以电流算好一些吧。一般都是衡流吧。最好电流小一些。
【4】看你写的，可以看到10KD的Marker,但是膜上和胶上都有，说明还是不放心。正常应该全部转到膜上才好，估计你也是担心小分子的转过头了。所以，你现在首先要确定目的蛋白转到膜上了。其实，不用丽春红染色，用眼直接看，比用丽春红染色的还要清楚。方法是，但转膜完成后，把膜拿出来，在膜逐渐干燥的过程中，膜会逐渐变成白染色。当膜刚变成白染色的时候，上面就会出现一些湿的、未干的条带，这些条带就是蛋白条带。当然，再过一会，这些条带也会变白的，所以，要一直看着。
【5】综合一下，最好一步一步来，每一步的条件摸准。先保证胶上有，然后湿保证膜上有，然后再曝光。这样就可以做到结果没出来的时候，心中有数，到底是哪里出了问题。
【45】92kd的蛋白应选什么浓度的分离胶和浓缩胶啊 答：【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：
（1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD)
6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150 8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90 10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80 12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD) 15 －－－－－ －－－－－－ －－12-43 10 －－－－ －－－－－－－－－16-68 7.5 －－－－－－－－－－－－36-94 5.0 －－－－ －－－－－－－ －57-212
【2】浓缩胶一般都是选4％或者5％ 下面是5％胶的配制方法：
成分 ----- 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10
蒸馏水 － － 1.4 － － 2.1 － － 2.7 － － 4.1 － － 5.5 － － 6.8
30?r-Bis(29:1) － － 0.33 － － 0.5 － － 0.67 － － 1.0 － － 1.3 － － 1.7 1M Tris, pH8.8 － － 0.25 － － 0.38 － － 0.5 － － 0.75 － － 1.0 － － 1.25 10%SDS －－ 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 －－ 0.06 － － 0.08 － － 0.1 10%过硫酸铵 － － 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 － － 0.06 －－－ 0.08 － － 0.1 TEMED － － 0.002 －－ 0.003 －－ 0.004 － － 0.006－ － 0.008 － － 0.01
【46】beta-actin 为43kd ，用的是湿转，200MA 1h, NC膜，可以成功将蛋白转到膜上，今天用的是pvdf膜，0.22um孔径，同样是湿转 200MA 1h,结果转膜后丽春红染膜未见条带，请高手指点!不胜感激！
答：1.转PVDF膜时,首先膜要先用甲醇浸泡,浸泡时间一般是1-20分钟,我用的是5分钟,甲醇浸泡后用转移液浸泡,浸泡时间我用的是比较长,我一般是用两小时,就是早早的就把转移液放到盘子里,海绵,滤纸也都放到里面.把PVDF膜泡透是比较重要的一步.
2.转移液要经常换新的,一般认为转移液可以用3-5次,但是我都是用两次就换新的,感觉次数多了.就不好用了,容易导致转膜的时候转不上,或者使膜上的蛋白条带发生弯曲,偏移,分散.
3.转膜的时候容易产热,所以转移槽里面最好加冰槽.我是里面加兵槽,外面用冰围起来(把转移的装置放在塑料脸盆中).这样的转移效果比较好.我用的是MILIPORE 的PVDF膜 ,我用的转移时间是300毫安半小时.当然膜不同,转移装置不同,所用的转移时间也可能不同.
4.还有很重要的一点就是,当膜上染色没染出来时,暴光的时候也可能出现条带,只是条带可能比较弱,暴光时间要长一点.