如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行灭菌，采血在无菌条件下进行。
PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。
实验六 线粒体和液泡系的超活染色
一、实验目的
1. 观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；
2. 学习一些细胞器的超活染色技术．
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法.其目
的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡.活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态.
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同, 活体染色可分为体内活染与体外活染两类.体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内,染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的. 体外活染又称超活染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料因其“电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色．
但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用.詹纳斯绿Ｂ和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性．詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基. 中性红对液泡系的染色具有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核和细胞质不着色,这可能与液泡中的某些蛋白质有关.
三、实验用品
１. 器材：
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显微镜、恒温水浴锅、、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸
２.试剂：
①Ringer溶液
氯化钠,０.８５g;氯化钾,０.２５g;氯化钙,０.０３g
②1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液
称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5ml Ringer溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液.
取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力.
③1/3000中性红溶液
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存.
临用前取1ml1%原液加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用.
3.材料： 人口腔上皮细胞 洋葱鳞茎内表皮细胞 绿豆幼根根尖
四 实验方法
（一）线粒体的超活染色与观察
１. 人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 载玻片于37℃恒温水浴： 1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液 2滴 人口腔上皮细胞黏液 牙签刮取
染色10－15min，盖上盖玻片，吸去周围染液，显微镜下观察．
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２. 洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察 载玻片于37℃恒温水浴： 1/5000詹纳斯绿B溶液 １滴 洋葱鳞茎内表皮 镊子撕取
染色10－15min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片，显微镜下观察．
（二） 绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察
载玻片于37℃恒温水浴：
初生绿豆幼苗根尖（1－2cm）纵切面切片 １片 1/3000中性红溶液 １滴
染色5－10 min，吸去染液，加Ringer溶液１滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察．
五、结果与分析
1.绘出人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析； 2.绘出绿豆幼根根尖细胞示液泡系的形态与分布并简要分析．
实验七：叶绿体和细胞核的荧光观察
一、实验目的:
1. 观察叶绿体的自发荧光和细胞核的次生荧光 2. 熟悉荧光显微镜的使用方法
二、实验原理:
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间。
三、实验材料与用品：
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实验材料：烟草、大葱叶片
试剂：O.01%吖啶橙 ，0.9％氯化钠溶液。
仪器与器材：刀片，眼科镊子（直头），载玻片，盖薄片，滴管， 微量加样器，枪头、1.5ml
离心管、离心管架、锡箔纸、普通显微镜，荧光显微镜
四、实验方法:
1、徒手切片或撕取叶片表皮条在普通显微镜观察叶绿体形态
用刀片将新鲜的叶片削出一斜面，沿斜面切下一薄层完整组织，置于载玻片上，递加1-2滴0.9％NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。
2、徒手切片叶绿体自发荧光观察
相同方法制备叶片徒手切片，置荧光显微镜下，用蓝光激发光照射标本，观察记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。
3、叶绿体和细胞核次生荧光观察
叶片的徒手切片或表皮条至于载玻片上，递加1-2滴O.01%吖啶橙，染色1分钟，加盖玻片，置荧光显微镜下观察。用紫外激发光照射标本，记录细胞中叶绿体的形态、数目和分布状况。
五、实验结果与分析
1、普通光镜下，可看到表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2、荧光显微镜下，在蓝光激发光照射下，叶绿体发出火红色荧光。
3、加入吖啶橙染色后，叶绿体发出桔红色荧光，细胞核发绿色荧色。
六、思考题：
加入吖啶橙染色后，叶绿体和细胞核各发出什么颜色的荧光？为什么？
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七、注意事项:
1. 吖啶橙为致癌物，使用时注意不要涂到皮肤、实验台等其它器皿上。用过的载玻片放到
指定地点统一处理。 2. 使用荧光显微镜时要正确操作
3. 吖啶橙易分解，染色时要致黑暗处，观察时动作要快。
实验八：细胞骨架的观察
一、 实验目的:
掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架的方法。对细胞内细胞骨架的网状结构有一个整体上的认识。
二、实验原理:
植物细胞用适当浓度的TritonX-100处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，考马斯亮蓝R250是一种蛋白质染料。处理后的材料固定和染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。
三、实验材料与用品： 实验材料：洋葱鳞叶，烟草叶片
试剂：(1)0.2％考马斯亮蓝R250染色液：称考马斯亮蓝R250 1g，溶于250ml无水乙醇中，
加冰醋酸35ml，再加蒸馏至500ml。
(2)磷酸缓冲液(pH 6.8)：0.1M磷酸缓冲液，pH6.8。
(3)M缓冲液(pH 7．2)：50mmol／L咪唑， 50mmol/L氯化钾，0.5mmol／L氯化镁, 1mmol/L
EGTA, 0.1mmol/L EDTA, 1mmol／L巯基乙醇(DTT)，调至pH 7.2。
(4)1%Trion X-100：用M缓冲液配制。
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