而对于临界值血清，ELISA法测定HBV-M出现假阳性、假阴性反应明显高于TRFIA法。
2． 讨论
有报道[2]用ELISA法测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb结果与MEIA法的结果符合率依次为96%、97%、98%、89%、93%，与本实验170份随机标本用ELISA及TRFIA法结果符合率相符(99.41%、94.12%、98.8%、93.53%、91.76%)，资料显示，测定五项HBV-M的灵敏度及特异性ELISA法普遍低于TRFIA法，究其原因，可能与两法反应原理不同密切相关。 TRFIA用三价稀土原子（Eu3+）及其鳌合物作示踪物，代替酶和标记抗原、抗体，并且当免疫反应结束后，根据Eu3+离子鳌合物的荧光光谱的特点，采用解离-增强技术放大有效荧光，最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度，根据已知浓度确定的标准曲线来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。朱艳冰等曾用Eu3+建立双抗体夹心的TRFIA法测定HBsAg，获得了满意结果，灵敏度高于ELISA法且具有不受样品背景荧光干扰，精确度高，线性范围宽（0~100ng/ml）等优点，且标记物制作稳定，显示出良好的应用前景[3]。
TRFIA为定量方法，经统计，该法测得三种HBV-M含量与MEIA法比较有良好的线性关系，尤其是HBsAb， r＝0.918。由于HBsAb为保护性抗体，在含量达到一定时，对机体有免疫保护作用，因此，良好的测定线性关系对于决定病人是否需要接受疫苗接种，提供了可靠的指标。HBsAg含量多少在一定程度上反映乙肝患者的病情，故定量的测定方法对于临床疗效的观察有一定参考价值。
TRFIA作为一种灵敏度高、特异性及重复性好的定量免疫测定方法，近年来应用范围不断扩大[4、5]。对于大型的实验室，应用各种非放免标记、非发色酶标的自动化设备来进行分析，是技术发展的趋势，相信在不久的将来，TRFIA法在各大实验室的普及将成为必然。
参考文献
[1] Pao cc，et al.Am J Clin Pathol 1991；95：591
[2] 黄波，张国元.ELISA法测定乙肝两对半中两种判断结果探讨.川北医学院学报，2003，18（1）：112
[3] 朱艳冰，李庆国，王桂兰等.新型铕络合物用于HBsAg的时间分辨荧光免疫.标记免疫分析与临床，2002，9（3）：157
[4] 顾爱萍，朱雪明，单卫民，等.丙型肝炎病毒抗体的时间分辨荧光分析法检测.临床检验杂志，2001，19（4）：215
[5] 黄飚，肖华龙，朱利国，等.糖蛋白抗原19-9时间分辨荧光免疫分析.中华检验医学杂志,2000，23（3）：171
时间分辨荧光免疫测定技术在HBV-M 定量检测及临床应用分析
蔡意和 2004-7-24 15:34:00 中华中西医杂志2004年3月 第5卷 第6期
【摘要】
目的 研究乙肝病毒感染者血清免疫学标志物，利用时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）检测其含量结果与ELISA法结果的符合程度、灵敏度、特异性;了解TRFIA测定HBV-M的准确性、可行性及临床应用价值。
方法 分别用TRFIA和ELISA法测定260例随机血清标本HBV-M结果及含量。结果 HBsAg（ELISA）阳性36例，TRFIA阳性40例，χ 2 =4，P<0.05，两法符合率98.46%;抗-HBs（ELISA）阳性130例，TRFIA阳性160例，χ 2 =30，P<0.01，两法符合率88.5%;HBeAg（ELISA）阳性17例，TRFIA阳性18例，χ 2 =1，P>0.05，两法符合率99.6%;抗-HBe（ELISA）阳性86例，TRFIA阳性73例，χ 2 =6.76，P<0.01，两法符合率90.4%;抗-HBc（ELISA）阳性54例，TRFIA阳性72例，χ 2 =15.6，P<0.01，两法符合率91.5%。结论TRFIA法与ELISA法比较，特异性、敏感性都高，TRFIA作用于HBV-M含量检测可为临床间接反映病毒的感染状况，同时也为临床疗效提供动力学观察及接种乙肝疫苗提供依据。
关键词 HBV-M 时间分辨荧光免疫分析技术 酶联免疫吸附试验
目前国内临床实验室最常用的乙型肝炎病毒（HBV）感染者的血清学标志物检测主要靠ELISA法，由于ELISA法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的限制，它不能提供HBV-M的具体含量，只能作为阴阳性判断，故不可能完成HBV感染的动力学观察，而时间分辨荧光免疫技术的出现提供了对HBV-M进行定量检测的手段。本文采用TRFIA法对260份血清标本进行HBV-M检测，并与ELISA法结果进行比较和分析。现报告如下。
1． 对象与方法
1.1 对象 血液标本均来自本院门诊及住院病人260例，无年龄性别要求。早晨空腹抽取静脉血，分离血清后立即检测。
1.2 检测试剂 ELISA试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。TRFIA试剂盒由上海新波生物技术有限公司提供。
1.3 仪器 EL-312e酶标仪。Anytest2000时间分辨荧光分析仪。Egate2310全自动洗涤。2510变频振荡器。
1.4 质控物 由卫生部临床检验中心提供。
1.5 方法 ELISA法和TRFIA法测定HBV-M，严格按照试剂操作规程操作，同时加入相应
质控物监测。
1.6 统计学方法 采用配对χ 2 检验。 2． 结果
2.1． HBsAg ELISA法 结果阳性36例，阳性率13.8%;TRˉFIA法结果阳性40例，阳性率15.4%;两法都阳性36例，两法都阴性220例，TRFIA阳性而ELISA阴性4例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =4，P<0.05，差异有显著性，两法比较符合率为256/260=98.46%;其中HBˉsAg含量0.5～5ng/ml占4例，6～25ng/ml占7例，26～50ng/ml占8例，51～150ng/ml占8例，150ng/ml以上占13例。
2.2． 抗-HBs ELISA法 结果阳性130例，阳性率50%;TRFIA法结果阳性160例，阳性率61.5%;两法都阳性130例，两法都阴性100例，TRFIA阳性而ELISA阴性30例，TRˉFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =30，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为230/260=88.5%;其中抗-HBs含量10～100mIU/ml占79例，101～200mIU/ml占16例，201～1000mIU/ml占46例，1000mIU/ml以上占19例。
2.3． HBeAg ELISA法 结果阳性17例，阳性率6.5%;TRˉFIA法结果阳性18例，阳性率6.9%;两法都阳性17例，两法都阴性242例，TRFIA阳性而ELISA阴性1例，TRFIA阴性而ELISA阳性无，采用配对χ 2 检验，χ 2 =1，P>0.05，差异无显著性，两法比较符合率为259/260=99.6%;其中HBeAg含量0.03～0.1NCU/ml占1例，0.11～0.5NCU/ml占4例，0.51～2NCU/ml11例，2.1～8NCU/ml2例。
2.4 .抗-HBe ELISA法 结果阳性86例，阳性率33%;TRˉFIA法结果阳性73例，阳性率28%;两法都阳性67例，两法都阴性168例，TRFIA阳性而ELISA阴性6例，TRFIA阴性而ELISA阳性19例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =6.76，P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为235/260=90.4%;其中抗-HBe含量1.5～2NCU/ml4例，2.1～5NCU/ml14例，5.1～10NCU/ml23例，20NCU/ml以上24例。
2.5. 抗-HBc ELISA法 结果阳性54例，阳性率20.8%;TRFIA法结果阳性72例，阳性率27.7%;两法都阳性52例，两法都阴性186例，TRFIA阳性而ELISA阴性20例，TRFIA阴性而ELISA阳性2例，采用配对χ 2 检验，χ 2 =15.6P<0.01，差异有非常显著性，两法比较符合率为238/260=91.5%;其中抗-HBc含量0.1～0.5NCU/ml11例，0.51～1NCU/ml1例，1～5NCU/ml10例，5.1～10NCU/ml36例，10NCU/ml以上14例。
3. 讨论
TRFIA法检测HBV-M与ELISA法相比，其特异性和敏感性都高，特别是能够检测低浓度HBsAg和HBeAg，对减少HBV感染漏诊和误诊具有较高价值。因HBsAg阳性是HBV感染的金
标准［1］ 。有学者对血清呈低水平存在、血清HBsAg约在5ng/ml以下者做过研究 ［2］ ，对象是非肝炎患者住院人群，结果是占总人群的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%。而本文只检测出1.5%和10%。此结果存在一定差异，有待进一步探讨。抗-HBs是对HBV的保护性免疫指标，有学者认为仍有保护作用的最低抗-HBs的浓度为10mIU/ml，提出基础免疫后高度抗体滴度的再接种方案，最后一次接种后4周，如抗-HBs<10mIU/ml立即再接种;10～100mIU/ml，3～6个月后必须再接种 ［3］ 。实际工作中发现，抗-HBs定量检测对于监测、指导肝移植中乙型肝炎免疫球蛋白的应用具有肯定作用。说明了对抗-HBs定量的检测是很有必要的，同时也可了解人体是否有抗- HBs、是否有足够的量可抵御HBV的侵袭。本文抗-HBs结果显示，160例TRFIA法阳性79例，抗-HBs浓度值在10～100mIU/ml以内，此量因无确切的抵御能力，建议加强预防措施。对于抗-HBs阴性的人群更应做好预防，至于100mIU/ml以上含量的人群，说明他们已有好的抵御能力。另外结果提示，ELISA法的抗-HBe阳性率明显高于TRFIA法，由于本身方法学的限制，最好在发出报告时加以综合分析或提高Cutoff值。
从实验结果表明HBV-M各项阳性结果都显示了不同的含量，说明了人体感染HBV后，病毒的复制程度或经抗病毒药物治疗后，HBV-M含量也随之变化，提示了动力学关系。据所掌握的资料观察，患者治疗前及治疗后HBV-M含量变化结果比较。
目前临床上对检测HBV-M的血清学常用方法是血清免疫学检测，也就是检测患者对病毒侵染机体产生的免疫反应，因此免疫血清学指标可间接反映病毒的感染状况。随着检测水平的不断提高，TRFIA技术的问世给免疫自身的研究和发展提供了新的手段。虽然DNA是直接反映病毒本身在机体内的存在情况，而人们越来越意识到两者既相关，又不尽一致，高灵敏准确的HBV-M定量结果可与HBV-DNA的检测相互印证，给临床提供更客观有效的实验报告，临床上需要将两者结合起来对患者进行综合诊断、治疗和预后等判断。如果在没有开展HBV-DNA项目检测的单位，HBV-M含量检测其本身也就是一个很好监测病毒动力学变化的辅助指标。
参考文献
1 陈紫榕.病毒性肝炎.北京:人民卫生出版社，2002，6，191.
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3 Klaus-Peter Maier著，郝连杰等译.肝炎及其后果.第四版.北京:人民卫生出版社，1997，8，35.
时间荧光免疫（TRFIA）法乙型肝炎病毒的检测及临床意义
我国在世界上属于乙型肝炎病毒（乙肝病毒，HBV）感染的高发区，乙肝表面抗原（HBsAg）的携带者已超过10%，HBV具有明显的种属及嗜肝特性（尽管其亦可感染肝以外的组织、器官或细胞，如脾、睾丸、人外周血单个核细胞等），可致持续性病毒感染。通常判断HBV感染及其状况的指标为HBV的血清学标志物（HBVM），如HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc（即所谓的“两对半”）、抗HBc IgM和HBV DNA等。随着标记免疫学技术的飞速发展，特别是新型的TRFIA的应用，使HBV免疫检测趋于超微量化，了解这些指标在什么情况下出现及其临床意义，对于我们检验工作者来说，亦具有重要意义。
1. 乙型肝炎病毒的形态与结构
HBV属嗜肝DNA病毒科，为环状、双链DNA病毒，通过电子显微镜，在乙肝患者血液中发现三种颗粒:
（1）Dane颗粒，直径约42nm，内部具有核酸和核心抗原，所以是具有高度的传染性完整的DNA病毒;
(2）小球状颗粒，直径约22nm（16～25nm），是HBsAg主要成分，可刺激机体产生抗体，具有中和病毒作用;
(3）管状颗粒，直径约22nm，长50～230nm（推测是由小球状颗粒串聚而成），主要由表面抗原S蛋白和一定量的前S 1 和前S 2 蛋白组成。后两种颗粒是不含有核心抗原和核酸的空心Dane颗粒，不具有传染性。
据研究认为管状颗粒可能成为完整病毒的外壳，是HBsAg在肝细胞内质网表达的主要形式，小球状颗粒为HBV颗粒从肝细胞向血液释放的主要形式。空心Dane颗粒无复制作用，称缺陷颗粒，研究表明它可能对HBV在细胞水平的传播和细胞内复制有干扰作用，又称之为干扰性缺陷颗粒。
乙肝病毒的基本结构主要包括:外膜、核壳体、核心蛋白、DNA聚合酶和基因DNA组成。乙肝病毒感染肝细胞和在肝细胞内繁殖:
（1）首先，HBV病毒的前S 1 和前S 2 蛋白与肝细胞受体结合，从而侵入细胞内; （2）脱去外膜蛋白，在细胞质内，DNA形成共价闭合环状DNA（cccDNA）;
（3）cccD-NA进入细胞核，脱核壳，并转录成信息核糖核酸（mRNA）释放到细胞质内; （4）mRNA经逆转录酶形成病毒DNA，同时产生病毒蛋白;
（5）这样HBV DNA在肝细胞内循环复制，同时和病毒蛋白装配完整的病毒分泌到血液循环中。