2. 时间分辨荧光免疫（TRFIA）定量检测乙肝两对半的意义
2.1 定量检测乙肝表面抗原的临床意义 目前TRFIA检测乙肝表面抗原（HBsAg）的参考值为0.5ng/ml，大于此值表明已有HBV感染。定量检测HBsAg，对肝炎病人动态疗效观察很有价值 ［1］ 。
HBsAg存在于Dane颗粒的外核及小球状颗粒和管状颗粒中，具有抗原性，不具有传染性，是HBV感染的特异标志，具体临床意义如下。
2.1.1 抗原的检测为乙型肝炎临床诊断和治疗提供病原学依据 乙肝表面抗原（HBsAg）是HBV感染的特异标志，HBsAg的出现就可作为乙肝的早期诊断，绝大多数HBV感染者外周血可出现HBsAg，含量在5ng/ml～600μg/ml之间，高者可达2000μg/ml。有作者认为HBsAg含量在0.1ng/ml时就有传染性，并且有研究表明HBsAg的含量与HBVDNA具有相当的相关性 ［2］ 。时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）检测HBsAg灵敏度可达0.2ng/ml，而酶标（EIASA）检测的灵敏度为（0.5～2）ng/ml，放射免疫（RIA）灵敏度是（0.5～1）ng/ml，TRFIA极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HBsAg，确证HBV感染，缩短窗口期;其次，可发现低浓度HBsAg携带者;在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答，HBsAg表达较低，酶标检测可出现HBsAg和表面抗体（HBsAb）均阴性的情况，TRFIA技术的高灵敏度则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。并且目前病毒性肝炎和其他病因所致的肝病甚多，而且临床症状、体征及肝功能无特殊改变差异，故只有依靠高灵敏度的病原学鉴别诊断。
2.1.2 乙肝表面抗原检测是婚前体检及是否引起垂直传播和献血筛查的重要指标 HBV的传染性很强，据报道，接种0.00004ml含病毒的血足以使人发生感染，而婴儿表面抗原携带是社会上迁徙表面抗原携带者的主要来源。其传播方式可经胎盘和产道传播，分娩时母亲产道内通过婴儿的皮肤、黏膜或口腔传入。而新生儿和婴儿期的免疫系统不成熟，对外来的病毒不能识别和消灭，故形成感染。HBV感染的年龄是重要因素:新生儿和婴儿期感染约90%以上会成为慢性感染，2～6岁儿童感染约20%～30%以上会成为慢性感染，6～12岁感染约10%以上会成为慢性感染，成人（包括12岁以上的青少年）感染约≤5%以上会成为慢性感染。Michielsen等认为，母婴传播的危险性取决于HBV的复制水平，母亲HBsAg浓度越高，特别是有e抗原阳性者感染其婴儿的机会为80%～90%。其次表面抗原检测筛选献血员和预防输血后肝炎的重要措施。对每一份供血均应检测表面抗原和核心抗体，任何一项阳性者不能作为献血员为血库和病人提供血液。据文献报道，目前为止在献血员所发现的HBsAg携带者最低含量为0.2ng/ml，有的甚至达2000μg/ml以上，TRFIA微量检测为献血员筛选和预防输血后肝炎提供了有利的技术检测。
2.2 表面抗体（抗-HBs）定量检测能够对乙肝预防起监督作用 目前TRFIA检测乙肝表面抗体（抗-HBs）的参考值为30mIU/ml，大于参考值表明机体已产生抗体。机体感染HBV后，产生的抗-HBs认为与循环中病毒清除有关，故抗-HBs是一种保护性抗体，是对乙肝感染后获得免疫力的标志，乙肝治愈或趋向治愈的象征。其量在10～100mIU/ml定性检测可呈阳性结果，但此时机体免疫力较低，甚至不能预防HBV感染;量在100mIU/ml以上才具有抵抗HBV入侵的作用;但也有人提出，10mIU/ml抗-HBs为具有免疫力的临界水平 ［3］ 。TRFIA检测HBsAb的灵敏度可达5mIU/ml，故表面抗体定量检测，可以判断机体对HBV的免疫状态及乙肝疫苗的效果，特别是少年儿童预防方面有重要意义。
2.3 定量检测乙型肝炎e抗原（HBeAg）及e抗体的意义 目前TRFIA检测乙肝e抗原（HBeAg）的参考值为0.03Ncu/ml，e抗体（抗-HBe）的参考值为2.0Ncu/ml，大于参考值表明机体已产生相应的抗原或抗体。
感染HBV后，HBeAg及抗-HBe的出现与HBsAg的滴度（1:32）呈一定的关系 ［4］ ，HBsAg浓度越高HBeAg检出率越高 ［5］ ;有文献报道HBV-DNA含量与HBeAg、HBsAg的存在有明显关系，HBeAg、HBsAg在一定程度上也能反映HBV-DNA的复制程度 ［6］ 。血清学显示，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBVDNA）和HBeAg的消失反映了HBV的清除 ［7］ ，有文献 ［7］ 研究表明，用拉米呋啶治疗乙肝患者，对HBV-DNA有效抑制率可达83.3%，低于检测限达50%;但对HBeAg的有效抑制率只有60%，转阴的只有13.3%，这可能是拉米呋啶可抑制HBV DNA聚合酶，造成HBV DNA合成终止，但不能消灭病毒超螺旋体，因而HBeAg呈阳性，停药后极易复发，且有研究报道82.49%的HBeAg阳性血清可检测出HBV DNA。 HBeAg为乙肝核心抗原的可溶成分，是乙肝传染性标志，表明体内有大量HBV-DNA复制，也是急性乙肝发展为慢性的重要指标，HBeAg与HBV存在着特殊相关的联系，仅能在HBsAg阳性的血清中检出 ［5］ 。在乙肝急性期HBeAg在发病3个月后持续阳性，则可能是急性乙肝发展为慢性的最早依据，患者肝组织伴有严重损害，易演变为慢性肝炎和肝硬化。慢性肝炎中HBeAg持续阳性提示HBV持续感染，是肝炎活动期的标志，而且发展肝硬化的概率比较高，HBeAg阳性孕妇是社会上婴儿表面抗原携带者的主要来源，应该引起全社会的关注。
抗-HBe主要存在于HBsAg阳性携带者及迁延稳定或恢复期肝炎患者的血清中，有研究表明抗-HBe检出率为肝癌>肝硬化>慢性乙肝，提示多数抗-HBe检出患者HBV感染时间较长，且抗-HBe主要见于低浓度HBsAg或抗-HBs阳性的急、慢性患者 ［3］ 。一般认为高浓度的抗-HBe也是乙肝病情好转的标志，但有实验证明多达36%的抗-HBe携带者具有相当数量的乙肝病毒颗粒，并值得注意的是部分患者仍能检测出HBV-DNA或高浓度HBsAg，可能:（1）
HBsAg的清除依赖T细胞体液免疫应答，当HB-sAg持续高水平时T细胞免疫应答受抑制;（2）HBV感染后，细胞毒T淋巴细胞（CTL）识别病毒抗原表位在机体免疫压力下发生变异从而逃避免疫清除有关，并且慢性感染者CTL反应微弱甚至无。甚至有作者认为抗-HBe可能是一种蔽护性抗体 ［4］ ，HBV逃避了机体免疫清除。
故定量检测HBeAg是有效监测乙肝复制及耐药和评估抗病毒药物疗效的指征，抗-HBe对预后判断起了很大的作用。
2.4 定量检测核心抗体（抗-HBc）的意义 目前TRFIA检测乙肝核心抗体（抗-HBc）的参考值为0.1Ncu/ml，大于参考值表明机体已产生相应的抗体。
核心抗体是最敏感的乙肝感染指标，有研究表明抗-HBc浓度波动与病情呈平行关系，与病毒增殖和肝细胞损害有关，在临床上常用高浓度或低浓度来判断乙肝的转归和预后，如果检出高滴度（1:1000以上）抗-HBc提示患病中 ［3，5］ 。卫生部临检中心规定用RIA测定抗-HBc时，当抗-HBc浓度>60Ncu/ml已具有临床意义，提示患病中，应采 取一定的治疗措施;在2～60Ncu/ml时已具有流行病学意义。随着HBsAg阴转或抗-HBs出现，抗-HBc阳性率及浓度也随之降低 ［8］ ，且抗-HBc是HBV感染后血清中最早出现的标志抗体，是流行病学调查的良好指标，其效价高，持续时间长，甚至终生携带。
据统计，普通人群单项抗-HBc的阳性率超过0.9%～20%，在乙肝中总检出率为70%～80%。出现单项抗-HBc的可能:
（1）慢性乙肝感染，HB-sAg水平很低，用一般的血清学方法检测不出HBsAg，即低水平HBsAg携带;
（2）急性乙肝感染恢复早期，HBsAg已经消失而抗-HBs尚未产生，即“窗口期”; （3）过去乙肝感染，由于抗-HBc比抗-HBs在体内存在的时间长，因此抗-HBs已消失或在检测水平以下时，抗-HBc仍存在;
（4）被动获得抗-HBc，输血抗-HBc阳性血液或血制品，注射有HBV感染后出现免疫反应者血液制备的乙型肝炎特异性免疫球蛋白均可被动获得抗-HBc而呈单项抗-HBc阳性。此外，母亲IgG抗-HBc可经胎盘传给胎儿，并于婴儿体内持续在1年以上。有研究报道，在HBsAg阴性血清中，结合抗-HBc检测，可提高HBV检出率26.3%。曾研究提出抗-HBc应作为献血员筛检项目 ［9］ ，也有报道抗-HBc在高滴度时，即使HBsAg阴性，也可能存在HBV感染 ［10］ ，有笔者主张应以高滴度抗-HBc阳性为筛检标准。
3. TRFIA在乙肝病毒检测中的应用
TRFIA（Time-resolved fluoroimmunoassay），又称解离-增强镧系荧光免疫分析（DELFIA）。铕（Eu）标记TRFIA是一种非放射标记超微量免疫检测技术，具有敏感性高、
重复性好、特异性强、定量范围宽、检测速度快、标记物稳定等突出优点，成为继放射免疫分析之后的新的里程碑。
HBVM的检测为HBV感染的最主要病原标志和直接证据之一，其变化是评估HBV感染后病情转归的重要依据，也是抗病毒治疗的疗效考核指标之一。TRFIA所特有的超强的稳定性和高灵敏度近年来在国内外得到广泛的认可，同时国内多家公司在时间分辨技术基础上开发的乙肝两对半试剂，填补了我国检验界在乙肝微量检测方面的空白，是对乙肝标志物微量检测方面革命性的突破。研究证实，在部分HBV感染的人群中，血清HBsAg呈低水平存在 ［11～13］ ，而且目前采用的酶标的检测方法，对低水平人群容易造成漏检 ［12～13］ ，在较大范围的非肝炎患者住院人群的检测结果表明:血清HBsAg约在5ng/ml以下者占总人数的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%，其中HBsAg在1ng/ml以下者占多数 ［13］ 。罗开忠等 ［14］ 与谭玉华等 ［15］ 均通过TRFIA定量检测乙肝两对半发现，大部分ELISA法检测为HBsAg、抗-HBc阳性模式的患者其实为HBeAg假阴性或HBeAb假阴性，仅少部分为病毒变异的结果，谭玉华等还通过TRFIA定量检测“乙肝两对半”发现部分ELISA单项抗-HBc阳性标本用TRFIA法能检测出HBsAg。1983年Siitari用TRFIA检测血清中HBsAg，并与RIA测定结果比较，结果TRFIA检测下限为0.2ng/ml，RIA为0.5ng/ml，TRFIA灵敏度高于RIA ［16］ ，TRFIA对低浓度的乙肝血清标志物有效检测，具有重要的临床及流行病学意义 ［11～15］ 。
TRFIA定量检测乙肝两对半能动态观察疗效和监测病情:
（1）定量分析HBsAg和HBsAb的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展;反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。
（2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转换的时期，即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb升高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的HBeAb一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。
（3）HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗-HBc提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-HBc持续高浓度。而低浓度的抗-HBc一般为恢复期或既往感染。
（4）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。 乙肝病毒感染后的常见临床转归:
（1）典型型:机体感染HBV后经过29～160天的潜伏期，于出现症状前1～2周可以在血清中检出HBsAg，紧接着出现e抗原，并伴有ALT的升高和临床症状，随后出现高滴度的抗-HBcIgM。经过2～3周e抗原下降而出现e抗体。HBsAb要在感染后3～6个月才能检出，一般机体在半年内恢复。病毒清除后几年内HBsAg、e-抗体可以逐渐下降，但抗-HBc可以保持存在，甚至终生。
(2）无血清转换型:主要特点是HBsAg、e抗原浓度高，并不转阴，HBsAb和e抗体一直不能检出，机体不能恢复，转为慢性肝炎。
(3）迟缓恢复型:血清主要特点是HBsAg持续阳性存在，e抗原持续约2年，e抗体在2年左右才能检出，机体恢复时间较长。
(4）隐性感染型:是无症状HBV感染者，HBsAg、e抗原在血清中存在时间短，浓度低甚至不易检出，HBsAb出现早，且浓度高。
（5）非典型恢复型:约占急性乙肝的10%，当症状和黄疸出现时，HB-sAg转阴，HBsAb出现早。另一特点是e抗原较HBsAg长几周，可以检出e抗原阳性HBsAg阴性。此类患者肝损害轻，病程短，预后佳。但也有少见重症肝炎患者。
因此，TRFIA动态、定量检测乙肝两对半的抗原抗体阳性模式能帮助临床分析机体免疫反应的机制，判断临床转归，及时预测耐药病毒株的出现和监测停药反弹能起到积极的指导作用，TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴的生物技术，将会对临床和科研产生更大的促进作用 ［1，14～16］ 。 参考文献
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