个。
四、实验内容与操作步骤 （一）MS培养基母液的配制
首先，按下表“MS培养基母液的配制”，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后，分别进行药品称取和母液配制。
规定用扩大 称取量mg 38000 33000 20 7400 3400 8800 22300 8600 6200 1000 830 250 25 25 3730 100 FeSO4·7H2O 维生素和氨基酸 烟酸 甘氨酸 27.8 0.5 2.0 4
母液定配1LMS母液种类 成分 量ml/L 倍数 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 容体积 培养基吸 ml 取量ml KNO3 NH4NO3 大量元素 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 微量元素 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O Na-EDTA 铁盐 1000 50 1000 1 1000 2780 10 25 100
Vit.B1 Vit.B6 肌醇 1.MS大量元素母液的配制
0.1 0.5 100 100 5 25 5000 1000 10 按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水800ml，放入1000ml的烧杯中，依次分别称取KNO3 38g; NH4NO3 33g, MgSO4·7H2O 7.4g, KH2PO4 3.4g, CaCl2·2H2O 8.8g，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50ml。 2.MS微量元素母液的配制
将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大1000倍，用电子天平分别依次称取MnSO4·4H2O 22.3g， ZnSO4·7H2O 8.6g , H3BO3 6.2g，KI 0.83g，Na2MoO4·2H2O 0.25g，CuSO4·5H2O 0.025g，CoCl2·6H2O 0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000ml倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为1ml。 3.铁盐母液的配制
在电子天平上准确称量2.78g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和3.73g乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA),分别倒入盛有400ml蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。将两种溶液倒入同一个1000ml的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000ml，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于4℃冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制1000mlMS培养基吸取此母液10ml。 4.MS有机母液的配制
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用电子天平依次称取：肌醇（环己六醇）5000mg，盐酸硫胺素（维生素B1）5mg，烟酸25mg，甘氨酸100mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500ml的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时，每配制1LMS培养基吸取该母液10ml。
5.植物生长物质母液的配制
? 2,4-D母液：准确称量2,4-D 50mg，先用1~3ml90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至100ml，即配成浓度为500ml/L的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存。NAA母液的配制过程与2,4-D相同。
? 6-BA母液：准确称量50mg 6-BA，加入少量碱溶液（如1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（1mol/L盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为500mg/L的6-BA的母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名称、浓度和配制日期，放入4℃冰箱保存备用。 5.注意事项
在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+，SO42-,PO43- 等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。
（二）培养基的配制与灭菌 1. 培养基的配方
本次实验，每组配制一种培养基，所配制的培养基配方如下： A. 愈伤组织诱导培养基：MS＋2,4-D 2 mg/L（单位下同） B. 白花蛇舌草不定芽诱导培养基：MS＋BA 3 +NAA 0.2 以上培养基均添加蔗糖30g/L、琼脂 7-10 /L，pH5.8。 2. 培养基的配制
① 称取母液：首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，
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量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。吸取量=需要配制培养基的体积×需要配制浓度/母液浓度
② 培养基定容：取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L。
③ 调节pH值：用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.8~6.0。用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。然后放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。
④ 分装：将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约20~30ml，盖上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。 ⑤ 培养基的灭菌：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。 3. 培养基的灭菌：
利用高压灭菌锅的灭菌步骤，整个过程大概需要2个小时，按以下步骤操作： ①设定压力为0.11Mpa，温度为121℃ ②三开（开出气阀、进水阀、外红阀）
③注水（开水龙头）至离进水显示柱高端1cm左右 ④三关（关出气阀、进水阀、外红阀） ⑤打开电源开关，通电
⑥夹层压力在0.1Mpa以下可以将培养基和无菌水等需要灭菌的物品放入灭菌室⑦夹层压力达到0.1Mpa时打开夹层与灭菌室的开关
⑧夹层与灭菌室同事升温升压，如停止不升温可以手动打开放气阀再放气3~5分钟，待冷空气全部排净就可以升温升压，待达到0.1Mpa、121℃时，灭菌锅会自动保温不会继续升温与升压，这时开始计时15~20分钟，（培养基灭菌需要15~20分钟、无菌水需要20~30分钟）
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⑨时间到，关闭电源，可以慢慢打开出气阀放气
⑩待温度与压力下降，80℃以下时可以将培养基与无菌水等移出灭菌锅备用。
4. 实验结果：一周后观察试验结果，描述培养基是否凝固及状态、颜色，如果实验失败（培养基不凝固）请分析原因，并自己找时间重新配置。 五、思考题：
1.培养基配置过程中应注意哪些因素？培养基为什么要煮沸后再分装？ 2.什么因素影响培养基的凝固？灭菌锅的应用应该注意哪些方面？
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