实验二 无菌操作及愈伤组织诱导技术
一、实验目的
通过实验，使学生了解外植体的选择和处理方法，初步掌握外植体材料的消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织的诱导方法。 二、实验原理
植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体植物器官或组织、甚至单个细胞的过程。接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和保证。经常使用的灭菌剂有酒精（70～75%）、次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴水和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。但氯化汞灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必须将材料用无菌水多清洗几次。消毒剂的种类不同，消毒灭菌的效果不同。因此，选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、灭菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗干净或能自行分解的物质。使用时需要考虑使用浓度和处理时间。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增值的无特定结构和功能的细胞团—愈伤组织，而植物生长调节剂2,4-D是诱导外植体形成愈伤组织的重要影响因素，本实验采用MS培养基添加2,4-D来诱导白花蛇舌草的愈伤组织。 三、实验器具与药品 ①材料：白花蛇舌草植株
②试剂及培养基：0.1%HgCl2（剧毒！小心使用） 、75%乙醇、无菌水 愈伤组织诱导的培养基：
MS＋2,4-D 2 mg/L；MS＋BA 3 +NAA 0.2
③器具：超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔。
四、实验内容与操作步骤
1、接种前，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，
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照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，在打开日关灯。用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后即可进行外植体的消毒和接种。
2、将外植体在自来水下冲洗干净，分别置于100ml烧杯中，用75%酒精浸泡30S后，移入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，然后在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后，置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将外植体切成0.5cm2的小块。以上操作都要在酒精灯火焰旁进行。
3、在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌的镊子，将外植体接种在培养基中，每瓶接种3~4块，封口后，熄灭酒精灯，瓶上贴上标签，注明姓名、接种日期及材料名称。
4、将上述接种有外植体培养瓶置于实验室的培养室内进行培养。并整理超净工作台台面。
五、实验结果及分析
1周后观察是否污染，2~3周后观察愈伤组织生长情况并进行简单讨论分析：愈伤诱导率（愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数）、愈伤形态、大小、颜色、质地。 六、思考题：
在接种过程中，通过哪些措施来防止杂菌对接种工具、接种材料的污染？
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实验三 植物器官分化的调控
一、实验目的
观察和分析不同植物生长调节剂配比对器官分化的影响，掌握愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。掌握离体培养中的器官发生调控技术。 二、实验原理
一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。愈伤组织的分化包括细胞分化、组织分化和器官分化形成三个层次。愈伤分化途径有两条：不定芽途径与体细胞胚胎发生途径。愈伤组织的分化方式与培养基中植物生长调节剂种类、浓度、比例有关。另外，培养条件也对愈伤分化有较大影响。 三、实验器具与药品
①材料：白花蛇舌草野生植株或以上试管无菌苗
②试剂：0.1%HgCl2（剧毒！小心使用）、75%乙醇、无菌水、新洁尔灭溶液 ③器具：超净工作台、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀、无菌水吸水纸、标签纸、记号笔。
四、实验内容与操作步骤
1、实验前准备：配制白花蛇舌草器官分化培养基。 培养基配方：
1. MS＋BA 3 mg/L（单位下同） 2. MS＋BA 3+NAA0.1 3. MS＋BA 3+NAA 3 4. MS＋BA 0.1+NAA 3 5. MS+NAA 3
以上培养基均附加30g/L的蔗糖，7~8g/L的琼脂，Ph5.8。高压灭菌。
2、按照实验二相同的步骤，作好无菌操作准备。
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3、取白花蛇舌草的嫩叶，经用少量洗衣粉洗刷后在自来水下冲洗1~2h，然后在超净工作台上用70%酒精消毒20s，再在0.1%升汞溶液加1~2滴吐温中灭菌10min，无菌水冲洗5~6次。在超净工作台上按无菌操作的要求用长镊子将外植体接种到培养基上。每瓶接种5片叶片，每种培养基接6-10瓶。 4、培养条件：温度25±2℃，光照12h/d,光照强度为2000LX。 五、实验结果记录
本次实验操作过程、接种瓶数、每瓶接种量。
观察记载在不同培养基中外殖体的变化过程、外殖体是否形成愈伤组织，外殖体上是否有不定芽的形成、每外殖体形成芽苗的数量（繁殖系数）、芽苗的质量如何？
观察愈伤组织诱导和分化结果，统计外殖体在不同培养基中器官发生的差异，结合理论学习进行分析。需要注意的是，愈伤组织的诱导和分化常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3－4周外殖体状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。
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实验四 试管苗的驯化、移栽和管理
一、实验目的
通过移栽操作，使学生掌握移栽基质的配制方法，试管苗的移栽技术及试管苗移栽后的管理技术。 二、实验原理
试管苗因其生活的试管内环境，其叶、茎上的角质层很薄，气孔调节能力弱，保水能力很差，根无吸收水分的能力。移栽后，应注意保湿、保温、无菌、弱光等方面，使苗得到锻炼，逐渐适应外界环境。‘ 三、实验器具与药品
1．用具和材料：解剖刀、镊子、乙醇灯、泥炭、珍珠岩、椰子壳粉、田园土等栽培基质。
2．材料：待移栽的生根试管苗。 四、实验内容与操作步骤
1．将需要移栽的试管苗瓶盖打开，注入少量自来水，置于驯化室内练苗3～5d。
2．泥炭使用前，需进行灭菌，灭菌温度为60℃，30min。然后把泥炭和珍珠岩按照1：1（或其它基质）的比例进行配制，测量其pH，若pH较低，添加CaCO3 调节pH至5～6*。
3．将基质填入穴盘，轻摇，用玻璃棒在每个穴孔中打1小孔。
4．将试管苗由培养瓶中取出，用清水洗掉苗上黏附的培养基。将试管苗一个一个分开，在玻璃板上用解剖刀将苗上的变褐部位切掉，栽入穴盘中，轻压培养基质，使苗根与基质紧密接触。
5．用手持小型喷雾器，对移栽的试管苗喷施一些低毒杀菌剂。 6．将栽有试管苗的穴盘移入炼苗架上，盖上塑料薄膜进行炼苗。
7．移栽后的5～7d，每天对移栽的小苗进行少量喷雾，以保持足够的湿度。然后逐渐降低湿度，可以采取每天将塑料薄膜揭开一小缝隙增加透风，降低湿度。
8．待苗移栽3周后，选择移栽成活的小苗移入营养钵内，置于一盆内，盆内加水，使水由营养钵底渗入。
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