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诱变育种能大幅度地增加菌种的变异量，从而人们能从诱变后的群体中筛选优良菌株。常采用物理、化学等诱变剂来动摇菌种的遗传性，直接或间接地作用于核酸物质，能强烈地引起菌种的变异。诱变育种的诱变剂很多，常用的有紫外线、X光线、Y射线及硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'广甲基N'亚硝基胍（NTG）等。
诱变育种方法有三个步骤：一是准备孢子悬浮液，将新鲜的食用菌无菌孢子移入5毫升无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液。孢子悬浮液的浓度以每毫升含孢子106～109个为宜。二是诱变处理，用诱变剂处理如紫外线处理，诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处，诱变处理时应先开灯20分钟，使波长稳定，然后将相于悬浮液倒入直径为6厘米的无菌培养皿中，打开皿盖，照射0.5～1分钟。照射后的孢子悬浮液每毫升所含的活孢子数约在105～108个。因此要得到单个菌落，必需先用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000～10万倍。然后取释释液0.2毫升涂布于装有琼脂培养基的培养皿上，在25℃下培养5～10天，这时就能在每个平板上得到数十个单菌落。选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，供进一步测定筛选。三是挑菌筛选，诱变处理只是扩大了它的变异范围，并不能决定变异的方向，所以诱变最大的困难是筛选，只有在大量的、各种各样的变异中，才能筛选到符合需要的变异个体。这样就需将诱变后的孢子经培 养长出菌落后应及时挑菌，选发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待外面长好后，再分别接 入2～4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生产性能，择优留取。
各位同仁，小弟我有一个想法，象诱变育种这种方法是非定向诱变，然后通过定向筛选来达到目的的，工作量很大，往往筛很久都没有什么好的结果，现在基因工程的快速发展，应该可以采取定向的诱变技术。
转贴：微生物育种 来自：华南师范大学
人们研究微生物遗传学的目的，就是为了更好地利用和控制微生物的遗传变异特性，使之为生产建设服务，为人类造福。在微生物工业上把所有通过培养微生物，使某种特定代谢产物大量积累的过程均称为发酵。目前，发酵已由野生型菌株发酵向代谢调控发 酵转移。所谓代谢调控发酵，就是利用遗传学的原理和方法，人为地在DNA水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量积累的发酵。代谢调控发酵的关键之一就
是选育从遗传角度解除了微生物正常代谢机制的突变株。微生物育种的方法目前主要是利用诱变、杂交和遗传工程等。 ?
一、突变与育种 ?
1.自发突变与育种 ?
生产中选育菌株--在日常生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可及时抓住这类良机来选育优良的生产菌株。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的新菌株。?
定向培育优良菌株--定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进 行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变 的 频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外，一般要相当长的时间。?
近年来，用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物的变异菌株，以提高相应代谢产物产量。这是定向培育工作中的进展。例如，异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物(即结构类似物)，两者分子结构类似：? 吡哆醇-----------------------------异烟肼?
定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株的方法：先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基 ，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上倒10ml含有适当浓度(据实验而定)的异烟肼的培养基，待凝。用此法制成的琼脂平板上存在着一个由浓到稀的异烟肼的浓度梯度(图8—31)。然后在平板表面涂大量微生物细胞，培养后，出现图8—31( 右)所示的结果。这是因为，右边是低浓度异烟肼区域，因此长满了原始的敏感菌，而左侧是高浓度异烟肼区，该区中微生物的生长受到了抑制。只有在适中的部位才出现少数由抗异烟 肼细胞形成的菌落。这类抗性菌落是由于供试菌中个别细胞产生了某种自发突变，所以能形成了抗异烟肼的突变体。根据微生物产生抗药性的原理，它们可能产生了分解异烟肼的酶类，也可能通过合成更高浓度的代谢产物(吡哆醇)来克服异烟肼的竞争性抑制作用。实验结果证明，多数菌株因发生了后一类的突变才获得抗性。因此，利用梯度平板法可达到定向培育某一 代谢产物高产菌株的目的。 2.诱变育种
?诱变育种是指利用物理或化学透变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度 提高，然后
设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过透变育种而大大提高了生产性能的。其中最突出的例子就 是青霉素生产菌株的选育。1943年，产黄青霉每毫升发酵液只产生约20单位的青霉素，通过透变育种和其它措施配合，目前的发酵单位已比原来提高了三四十倍，达到每毫升5万～10万单位。?
诱变育种除能提高产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的，故仍是目前使用最广泛的育种手段之一。? 诱变育种的基本路线
以选育在生产实践中最重要的高产突变株为例。概括表示如下：
-------------------诱变--绝大多数个体死亡 --------出发菌株--------{?-------多数未变 ??? -------------------------少数存活{---------多数负变
----------------------------------少数突变{---------多数幅度小
-------------------------------------------少数正变{-----------多数不宜投产 ----------------------------------------------------少数幅度大{
---------------------------------------------------------------少数适宜投产 诱变育种的原则?
----挑选优良的出发菌株--出发菌株就是用于育种的原始菌株。出发菌株适合，育种工作效率就高。参考以下实际经验选用出发菌株：①以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响；②采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株。由于有些菌株在发生某一变异后，会提高对其它诱变因素的敏感性，故可考虑选择已发生其它变异的菌株为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色 色素的菌株为出发菌株时，产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高。生产实践证明，经长期选用的菌株，继续用诱变剂处理，有时很难使其产量再提高，特别是生产水平已很高的菌株。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高 菌株对诱变剂的敏感性；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。?
处理单孢子(或单细胞)悬液--在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。有时，虽然处理的是 单核的细胞或孢子，但由于诱变
剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上。经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。?
由于上述原因，故在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；对芽孢杆菌则应处理它们的芽孢(因芽孢只有一个核质体，而其营养体一般有两个核质体)。?
细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。? 在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。?
选择简便有效、最适剂量的诱变剂--诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂如紫外线、X射线、γ射线和快中子等；化学诱变剂种类极多，主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。要知道某一诱变剂是否有诱变作用以及诱变作用的强弱程度，最理想的方法当然是设法直接测定它对提高某一菌种产量的实际效果究竟有多大。可是在具体工作中，由于此法工作量太大，定量性状不易确定，所以一般常用其他简便而间接的方法来定性确定。例如营养缺陷型的回变法、抗药性突变法、形态突变法或溶源细菌的裂解法等。采用这些方法的理论依据是：一切 生物的遗传物质都是核酸，尤其是DNA，一切诱变剂的作用机制都是引起DNA分子结构的改变。因此，凡对微生物有效的诱变剂，对高等生物同样有效，反之亦然。同时，凡能引起某一性状突变的诱变剂，对其他性状也必然有类似的作用。1973年建立的利用一组鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimulium)营养缺陷型的回复突变来检测各种化学物质对高等动物 是否有致癌作用的艾姆氏试验法(Ames test)，就是利用上述诱变剂“共性原则”的一个范例。利用这种大大简化后的方法，发现化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比关系(约有95%的致癌剂都是诱变剂)。?
目前常用的诱变剂主要有紫外线(U、V)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲基脲(NMU)等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。?
各种诱变剂有不同的剂量，用强度×时间表示，如紫外线的强度单位是尔格，X射线的单位是伦琴(R)或拉得(rad)等，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常采用杀菌率来作各种诱变剂的相对剂量。?
诱变剂的作用：①提高突变的频率；②扩大产量变异的幅度；③使产量变异向正变 (即提高产量的变异)或负变(即降低产量的变异)的方向移动(图8-32)。凡在高诱变率 的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。?
要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为99或99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。?
利用复合处理的协同效应--诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应(表8—6)。复合处理有几类：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。
二、原生质体融合育种 1.原生质体融合技术的发展?
-原生质体(protoplast)一词最初是由Hanstein用来表示植物细胞壁内的原生质。1952年，Salton用它来表示动植物和微生物细胞去除细胞壁以后的一种细胞结构。1953年，Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体。1958年，Brenner等人提出了细菌原生质体的 3条标准，即没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感。按照同样的标准，Eddy、Emerson、Bachmann等人用蜗牛酶配合其它条件分别从酵母菌或丝状真菌中释放出原生质体。Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝中制备出原生质体，并用噬菌体吸附及血清学 试验证明细胞壁确实溶解。日本的岗西等人对链霉菌原生质体的形成和再生的条件进行了系统的研究，其结果至今仍为不少实验室所引用。Landman等人以及Wyrick和Rogers对枯草杆菌的原生质体的形成和再生进行了研究。所有这一切，都为原生质体融合技术的创立提供了必要的条件准备。? 膜的融合是生物界中的普遍现象，如受精、胞饮、肌纤维的形成等均涉及到膜的融合。在1954年，Stahelin就曾用连续照像追踪了炭疽杆菌的原生质体融合。1985年，日本的冈田善雄发 现灭活的仙台病毒可以诱发细胞融合，从而奠定了细胞融合的技术基础。目前普遍采用的化学融合方法是在1974年才建立起来的，当时，高国楠发现聚乙二醇(PEG)在Ca?2+存在下能促使植物原生质体融合，并显著提高融合频率。接着，PEG的促融作用很快在微生物中得到证实，成功地实现了酵母菌、霉菌、放线菌和细菌等多种微生物在株内、株间、种间以及属间的融合，从而使原生质体融合技术在微生物方面形成了一个系统的实验体系。目前，原生质体融合已成为微生物遗传育种的一种新工具。 2.原生质体融合育种的特点?
原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。原生质体融合技术具有7个方面的优点：?