进单元化过程，最后在平板中挑取扇形角变的菌落孢子，即为单倍体分离子，经进一步筛选，从中获得所需要的优良菌株。 二、DNA shuffling技术
随着PCR技术的发展和应用，1994年美国的Stemmer提出了一个全新的人工分子进化技术――DNA shuffling技术（又称体外同源重组技术），该技术可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上万倍的功能性突变基因。其基本原理是先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片断，由这些随机小片断组成一个文库，使之互为引物和模扳，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片断最为另一个基因拷贝的引物时，引起模扳转换，导入体内后，选择正突变作新一轮的体外重组。一般通过2～3次循环，可获得产物大幅度提高的重组突变体。
我也来参与讨论：我来谈谈微生物诱变育种的方法和步骤.
1. 出发菌株的选择 用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。
另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。
2. 同步培养 在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。
3. 单细胞(或单孢子) 悬液的制备 这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时 pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，这样，可以保证菌悬液均匀
地接触诱变剂 ，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个／ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个／ml。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。
4. 诱变处理 首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。 A.紫外诱变
物理诱变剂中最常用的有紫外线。由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。
紫外诱变的方法是：将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。
B. CO60属γ射线 诱变
其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离
辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。
C. 等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。
D. 化学诱变剂 化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时还应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。
决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后，要有合适的终止反
应方法，一般采用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。
要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。
在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。
中间培养 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
分离和筛选 经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。
我有一个问题，紫外诱变得到的菌株怎样才能证明是突变菌呢？恳请 高手指教
诱变是不定向的,且一次正变幅度较小(ABOUT 5%),更有现有检测系统误差大于5%,企业急需的育种方法,是克服了这些难题的切实可行的定向育种方案.
有高招大侠可与我们联系
aefsw@tom.com
li36735528 wrote:
我有一个问题，紫外诱变得到的菌株怎样才能证明是突变菌呢？恳请 高手指教
根据你的需要检测吧,比如产量提高了什么的
我只有一个8瓦的紫外灯,用来做诱变可以吗?另外,我用变色圈法筛选菌种时,不是单菌落周围的培养基变色,而是整个培养基都变色.请问各位战友这是怎么个原因?
前几位同志大多讲到诱变方法的重要性，因为这含有更多共性的成分，但其实更重要的不在诱变，而在于筛选方法，如何准确快速获得所要的菌株更关键。这首先要了解目的菌种与出发菌种的特点，选择适当的方法，当然是高通量的方法。这在筛选当中更多地涉及到个性的问题，当然针对是缺陷型筛选还是抗反馈抑制筛选等等，有其共性的地方，但实际上的差别，尤其在高同量筛选方面很大。请大家讲一讲高通量筛选方面的问题好吗？
北方星空 wrote:
我只有一个8瓦的紫外灯,用来做诱变可以吗?另外,我用变色圈法筛选菌种时,不是单菌落周围的培养基变色,而是整个培养基都变色.请问各位战友这是怎么个原因?
8瓦的紫外灯应该也有效果,可能效果比15W的要差些.我没有用过,不敢断言,你可以试试.
你的平板整个培养基都变色的话也就没有什么意义了,应该是你选择的筛选培养基不合适.那样的话就只好更换培养基了
zzhangliang wrote:
各位同仁，小弟我有一个想法，象诱变育种这种方法是非定向诱变，然后通过定向筛选来达到目的的，工作量很大，往往筛很久都没有什么好的结果，现在基因工程的快速发展，应该可以采取定向的诱变技术。