加入了融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。已知霉菌与放线菌的融合频率为10?-3～10?-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10?-3～10?-6。?
受接合型或致育性的限制较小--由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体 的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制 比较小。?
重组体种类较多--由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换 ，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。?
遗传物质的传递更为完整--由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的 交换更为完整。原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起 的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或 稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。?
可获得性状优良的重组体--与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。例如，唐 氵尺昌彦等将氨基酸生产菌AJ3 419(AEC?r+ile?-)与Bl-4(AHV?r+l ys?-)的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC?r+AHV?r+ile?-+lys?-)，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1倍。?
可提高育种效率--采用温度、药物或紫外线照射等处理纯化一方亲株的原生体，然后再与另一亲株的活原 生质体融合，因此就可以在筛选中除去一方亲株，从而提高筛选效率。?
可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株--由于遗传标记如缺陷型往往影响工业微生物的某些生物合成能力，而进行一般基因重组时又 必须采用较多的遗传标记，因此势必使出发菌株的生产性能下降而影响杂交子代的生产水平。但由于原生质体融合频率较高，所以可以采用较少标记或不带标记的菌株进行融合，这对改良生产菌株性能更为有效。
除此以外，原生质体融合技术还具有存在着两株以上亲株同时参与融合以形成融合子的可能，以及提高菌株产量潜力机率较大等特点。因此，利用原生质体融合选育新菌株已受到国内外的普遍重视。? 3.原生质体融合育种的步骤?
原生质体融合育种一般包括如下步骤：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的再生；④原生质体的融合；⑤融合子的选择；⑥实用性菌株的筛选。原生质体融合的基本过程。
----标记菌株的筛选--在原生质体融合的过程中，通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于筛选。当然，所需的目的基因并不一定与标记基因连锁，但它毕竟可以大大减少工作量，提高育种效率。融合亲株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变育种方法，一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。在此必须注意的是标记必须稳定。采用抗药性菌株时，抗药性除可以作为标记外，在实验 中还可以排除杂菌污
染的干扰。至于标记的数量，Schaeffer指出，每个亲株都各带有两个隐性性状的营养缺陷标记就可以排除以后实验结果中获得的原养型融合子是回复突变的可能。所以选择性标记也无须过多。如果已知融合频率较高，为了减少标记对菌株正常代谢的干扰，也可以采用仅有一个标记的菌株作为融合亲本。当然，最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响甚大。因此，在选择标记时，尽可能采用该菌株自身已带的各种遗传标记。? ----原生质体的制备--获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。在细菌和放线菌中制备原生质体主要采用溶菌酶；在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素 酶。影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。?
----菌体的前处理--为了使酶的作用效果更好，可对菌体作一些前处理。例如，可在细菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等；在放线菌的培养液中加入1%～4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入ED TA和巯基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入2-脱氧葡萄糖等。加入这些物质的目的，就是使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。以细菌为例，甘氨酸可以使细胞壁肽聚糖中的L-丙氨酸和D- 丙氨酸残基为甘氨酸所取代，结果干扰了正常的交叉键合。青霉素能干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D-丙氨酸之间的联结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的细胞壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。环丝氨酸的结构与D-丙氨酸相似，可竟争性抑制丙氨酸消旋酶的作用，使L-丙氨酸不能转变为D-丙氨酸，结果细菌就不能合成N-乙酰胞壁酸五肽，细胞壁难以形成。?
----菌体培养时间--为了使菌体细胞易于原生质化，一般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。此时的原生质体形成率高，再生率亦很高。一般地说，对于细菌采用对数生长后期为好，对于放线菌，Baltz建议采用对数生长期到平衡期之间的转换期最为合适。? ----酶浓度--对于不同种属的微生物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说 ，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。由于影响原生质体形成和再生的因素相互有关，若原生质体形成率很高而再生率很低，对于原生质体融合育种来说不大适合。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。?
----酶解温度--温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而使酶失活。因此，最适温度是这两种效应的共同结果。另外 ，人们发现酶解温度对原生质体的再生影响甚大。因此，在选择最佳酶解温度时，除了要考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。一般地说，酶解温度应控制在20～40 ℃。?
----酶解时间--随着酶解时间的延长，菌体去壁程度愈完全，表现为原生质体形成率逐渐上升。当酶解达到一定时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质
体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成大量原生质体破裂，从而使原生质体失活，表现为原生质体再生率急剧降低。即原生质体的质量与酶解时间密切相关。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的再生率降低，最终亦不利于原生质体融合。因此，必须选择合适的酶解时间。?
----渗透压稳定剂--渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且还有助于酶和底物的结合。渗透压稳定剂多采用KCl、NaCl等无机物和甘露醇、山梨醇、蔗糖、丁二酸钠等有机物。菌株不同，最佳稳定剂亦有差异。在细菌中多用蔗糖、丁二酸钠、NaCl等，在酵母菌 中多用山梨醇、甘露醇等，在霉菌中多用KCl和NaCl等。稳定剂的使用浓度一般均在0.3～0. 8mol/L之间。?
----除此以外，破壁时的pH值、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响。?
----细胞壁溶解后，原生质体即以球状体的形态开始释放。杆状细菌的原生质体释放一般是从杆菌的一端进行的，棒状杆菌八字型排列细胞的原生质体释放是从棒状杆菌裂殖断裂一 端开始。由于原生质体比菌体细胞对渗透压更为敏感，所以在蒸馏水这样的低渗溶液中即可立即破裂，在一般培养基平板中也无法形成菌落。根据这一原理，原生质体形成率可按下式进行计算：
------------破壁前菌数-剩余菌数
原生质体形成率=-----------------------×100% -------------破壁前菌数
----原生质体的再生--酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。由于原生质体已经失去了坚韧的外层细胞壁，仅有一层100厚的细胞质膜，是失去了原有细胞形态的球状体。因此，尽管具有生物活性，但它毕竟不是一种正常的细胞，在普通培养基平板上也不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生出来，以恢复细胞原有形态和功能。?
----由于仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感，很容易破裂致使原生质外流而使细胞死亡，所以，再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂，这与原生质体制备一样。对于不同的微生物来说，其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的。表8-7列出了几种常用的微生物再生培养基中的主要成分。
原生质体的再生是一个十分复杂的过程，至今了解不多。据一些学者研究认为 ，若原生质体的 细胞壁剥离不彻底，则有助于细胞壁的再生。残留的细胞壁尤如结晶时的“晶种”一 样。大量实验亦证明，破壁太
彻底往往会引起原生质体再生率的大大降低。影响原生质体再 生的因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体制备条件、再生培养基成分及再生培养条件等。
----一般在进行融合实验前首先要对原生质体再生率进行测定，否则就很难确定不能融合或融合 频率低的原因是由于双亲原生质体本身没有活性或再生率很低，还是由于融合条件不适合所致。 因此，测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标 ，而且也是分析融合实验结果、改善融合条件的一个重要指标。原生质体再生率可用下式进行计算：
----------------------再生菌数-剩余菌数
----原生质体再生率=--------------------→×100% ----------------------破壁前菌数-剩余菌数
----一般地说，原生质体再生率通常在百分之零点几到百分几十，有的甚至可达100%。?
----原生质体的融合 --仅仅将原生质体等量地混合在一起，融合频率仍然很低，只有加入表面活性剂聚乙二醇(PEG)，融合频率才会出现突破性的提高。融合促进剂PEG具有强制性地促进原生质体融合的作用 ，其分子量有多种，从1，000到12，000，但在微生物原生质体融合时多用分子量为1，000至6，000的PEG，特别是4，000和6，000两种。在原生质体融合过程中，除了要加入PEG外，还要加入C a?2+、Mg?2+等阳离子，它们对融合亦有促进作用。?
----PEG诱导融合的机制 --君家德郎认为，PEG可以使原生质体的膜电位下降，然后，原生质体通过Ca?2+离子交联而促进凝集。另外，由于PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进了原生质体的相互融合。人们通过对植物原生质体融合的研究发现，融合的程序开始是由于强烈脱水而引起原生质体的粘合，不同程度地形成聚集场，原生质体收缩并高度变形，大量粘着的原生质体 形成非常紧密的接触。接着，接触处的膜间蛋白颗粒发生转位和聚集，然后邻近的脂质分子发生相互反应。由于Ca?2+等强烈地促进脂质分子的扰动和重新组合，结果使接触处的膜形成小区域的融合，产生小的原生质桥。原生质桥逐渐增大，直至两个原生质体融合。?
----影响原生质体融合的因素 --主要有融合剂的浓度、作用时间、阳离子浓 度及pH值等， 更为重要的是亲株本身特性的选择以及原生质体的活力。据报导，PEG的分 子量以4000～6000为好，由于PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率。因此，融合时PEG的 最终 浓度常采用30%～40%。由于PEG一加入，原生质体间的粘着即强烈地发生，融合就能较长时 间有效地进行，所以PEG的处理时间不需太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合 时间不宜过长。阳离子浓度对融合频率亦有很大的影响。已知融合时Ca?2+离子的
浓度 以0.01mol/L为最佳，而K?+、Na?+离子会降低融合频率。这是因为K?+、Na?+可优先结合到质膜上，从而降低了Ca?2+离子的刺激作用。关于融合时的pH值，人们发现在有 Ca?2+?存在的条件下，pH为碱性条件能刺激产生最大的融合频率。这是因为，融合时的 pH能够改变体系的电性状态，进而影响原生质体的融合。?
----Hopwood指出，若采取先用紫外线照射原生质体再进行融合，则可以大大增加融合频率。
融合子的选择--按照Schaeffer的观点，有两个遗传标记互补就可以确定其为融合子。因此，就可以通过选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体 。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。?
----为了提高融合子中基因重组的频率，可以将PEG处理的原生质体悬液直接培养于高渗选择培养基上，而不采用先培养于高渗培养基上然后再转接到选择培养基上的方法。这是因为，若早期就在完全培养基上再生，二倍体细胞于两条染色体复制之前就会发生分裂，结果重组机率下降。因此，为了获得较多的重组体，有些学者建议选择性地调节重组体再生的环境，可以稳定杂核子的形成和增加下一步的遗传重组能力。? ----实用性菌株的筛选--微生物原生质体融合是一种新的基因重组技术，它具有定向育种的含义。但是，融合所产生的融合子类型仍然是各种各样的，性能和产量不同的情况仍然存在。例如，丁友日方等以纯齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866为亲株进行原生质体融合，对所获得的融合子进行了初筛。 4.原生质体融合育种的应用 ?
----随着原生质体融合育种技术的发展，育种成果不断涌现。丁友日方等以球形芽孢杆菌TS-1和苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis)H4为亲株(前者对淡 色库蚊有高毒力，后者对粘虫及玉米螟等有高毒力)，在2～3mg/ml溶菌酶浓度下，42℃酶解45min，获得了原生质体。其原生质体形成率和再生率分别为91.02%、37.6%及93.3%、31.2%。然后将获得的原生质体以1∶1比例混合，加入40%的PEG于42℃保温5min。结果获得了既 杀双翅目又杀鳞翅目幼虫的融合子。日本的唐氵尺昌彦等 将赖氨酸生产菌AJ11082与谷氨酸生产菌A J11638进行融合，从融合子中选育出生长最快的AJ11794和AJ11793，该融合子在积累等量赖 氨酸(5.28g/dl)的情况下，其培养时间(31.5h)不到亲株(72h)的1/2?。?
----在链霉菌原生质体融合育种方面，邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新霉素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10?-4。其中58%产生巴龙霉素，并从中获得了巴龙霉素产量比原始菌株(300μg/ml)提高5～6倍的融合子。杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗 菌素抗性为标记选择种间融合子，从中获得了一株正定