（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gR-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。虽然此方案第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用此方法。
U3/6ProI NickTarget adaptorsgRNAregionTwo BsaI-cut ends are linked to an adapter Two BsaI-cut ends are linked to different adapters Two adapter ends of products II & III are polished to blunt and linked to produce IVII IV V III Two BsaI-cut ends are polished to blunt and linked together First PCR (2reactions):U-F/Reverse adaptor primerReaction 1Forward adapter Reaction 2primer/gR-RU-FIIIIV III gR-RTake 0.1 ml The product IV with doubled target sequence are amplified into two desirable fragments II & III, and the product V is not amplified. Second (overlapping) PCR:AnnealingSite-specific primer BsaIExtensionPCRBsaIBsaISite-specific primerBsaI
Figure 4．Generation of a sgRNA expression cassette by adaptor-ligation and PCR amplification
在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和sgRNA序列）先解离， U3/6和sgRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。
注1:为了提高接头连接效率，本操作中使用较高浓度（0.05 μM）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接(产物II, III)，而环状(双端)连接(产物I)较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等都可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（产物IV和产物V）。
4.1.2 sgRNA构建方法2 （以Overlapping PCR 往sgRNA表达盒导入靶序列）
这种方法不需要用Bsa I切sgRNA质粒和连接反应，更加简便，不会产生上述的产物IV和V。即设计的2条靶点引物3’端有15-17 nt分别与U3/U6启动子和sgRNA配对，用PCR扩增出片段后进行第二轮overlapping PCR。
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Target sequence (+)U-FU3/U6promoterVector backbonegRT#+sgRNAregion1stPCRgR-RU#T#-1stPCRTarget sequence (-)2ndPCR (overlapping PCR)AnnealingBsaIPpsExtensionPCRBsaIPgsBsaI BsaI
Figure 5. Procedures for generation of a sgRNA expression cassette containing a target sequence by overlapping PCR. The chimeric primers with target sequence strands are given in Table S2. The first PCR can be carried out in two separated reactions with U-F/U#T#- and gRT#+/gR-R primer pair, respectively, or in one reaction with the all 4 primers. U# in the primer names indicates a given promoter, and T#+ and T#- indicate forward and reverse strands of a target sequence, respectively.
引物设计例子靶点第1碱基与转录起始碱基相同(regular target)Target sequence转绿起始点GTCGGCCGGCAGCCGGATGACGG19 ntgRT#+TCGGCCGGCAGCCGGATGAgttttagagctagaaat-3（下划线与sgRNA配对）(#为靶点特异编号)OsU6aT#-OsU6bT#-OsU6cT#-TCATCCGGCTGCCGGCCGACggcagccaagccagca-3（下划线与OsU6a 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGACaacacaagcggcagc-3（下划线与OsU6b 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGACtgagcctcagcgcag-3（下划线与OsU6c 配对）TCATCCGGCTGCCGGCCGATgccacggatcatctgc-3（下划线与OsU3 配对）Target sequenceACAACACGACGACGTCGCCTCGGgRT#+OsU3T#-CAACACGACGACGTCGCCTgttttagagctagaaat-3AGGCGACGTCGTCGTGTTGTgccacggatcatctg（下划线与OsU3 配对）靶点第1碱基与转录起始碱基不相同(irregular target)TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTCGGgRT#+OsU6aT#-TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTgttttagagctagaaat-320 ntAGGAACGGAACTCCTTGCCACggcagccaagccag-3OsU6b, OsU6c, OsU3 的配对碱基与上面相同
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4.4靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法
本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子的表达水平为OsU6a>OsU6b >OsU6c > OsU3a。但打靶成功效率好像与sgRNA的表达水平没有明显的相关性(即在水稻sgRNA水平不是限制性因素)。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为：
1个靶点：LacZ-U6a
2个靶点：LacZ-U6a—U6b
3个靶点：LacZ-U6a—U6b—U6c
4个靶点：LacZ-U6a—U6b—U6c—U3
5个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6c—U3
6个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U3
7个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3
8个靶点：LacZ-U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c—U3—U3
注：由于靶点接头5’端4个碱基形成的粘性末端是根据使用的不同启动子而不同，要注意其对应关系。
sgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法(T1，T2为靶序列；U#为各启动子)：
1 cassette: Pps-GGL/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA
2 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;
3 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA;
4 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GG4, Pps-GG4/Pgs-GGR;
扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA
5个或以上靶点：如此类推。
4.5靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接方法
本载体系统可采用Golden Gate cloning (Engler et al., 2008; 2009), Gibson assembly方法(Gibson, et al., 2009, 2010) 2种策略组装Cas9载体和多个gRNA表达盒片段。
Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如图6, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU6a-LacZ (AtU3b-LacZ) 附有LacZ标记基因(198 bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。
SpeIBsaIMluIPB-LGolden Gate cloningT1ctcggagcOsU6a(B-L)LacZctgagactOsU6bT2aagattctOsU6cT3gactctgaOsU3T4MluI(B-R)cggtgccaPB-RBsaIFigure 6. Generation of a 4-target construct by Golden Gate cloning
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注：由引物Pps-GGL导入载体的唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”。其用途是，在构建好一组目的靶点sgRNA
表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点sgRNA表达盒，可以用Spe I将载体切成线状，再用Gibson Assembly将第二组靶点sgRNA表达盒克隆进去。如果连接较多（4个或以上）的sgRNA表达盒的
效率低（转化不能获得阳性克隆），就以连接产物为模板，以引物PB-L/PB-R (见Table S1)扩增出连接的多个表达盒，再次与pYLCRISPR/Cas9载体酶切连接。
5. 载体构建操作方法：
靶点设计，接头引物合成（sgRNA方法2）（sgRNA方法1）sgRNA质粒先切后连连接sgRNA质粒sgRNA表达盒连接物第一轮PCR(每种2反应)Overlapping PCR(同一反应用4种引物)sgRNA质粒BsaI酶切2反应扩增产物(混合)Golden Gate引物gRNA表达盒扩增产物Gibson Assembly引物第二轮PCRgRNA表达盒BsaI 切pYLCRISPR/Cas9质粒Golden Gate 连接（边切边连法用未切质粒）Gibson Assembly连接转化E. coli阳性菌落(蓝色），PCR确认，MluI酶切，测序
Figure 7. Workflow for preparation of multi-target CRISPR/Cas9 constructs
（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNA vectors菌种(DH10B)
分别在含有卡那霉素（25 μg/ml）和氨苄青霉素（50μg/ml）平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。用2-3U Bsa I试切~150ng质粒(10μl反应)，电泳检查是否切出690bp的ccdB条带（未切的80ng质粒为对照）。 注：不要将保存的菌种直接接种！
关键点：pYLCRISPR/Cas9载体较大（约15~16.5 kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取
纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度
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低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5?g/l）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/l冷冻保存，作为步骤（10）使用。
关键点：由于接下来要用到的Bsa I是很容易失活的酶，有时新买的Bsa I也是失活的！在进行以下步骤
之前，先检测Bsa I活性：配制10 μl Bsa I反应液，含有5 U Bsa I, ~100 ng pYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的质粒)。37℃反应15min后电泳检查，以未切的相同质粒为对照。pYLgRNA-U#的Bsa I图谱见Figure 3。为了尽可能保持酶活性，最好把Bsa I分装成几管冷冻保存。NEB公司的Bsa I-HF经过修饰以降低星活性，推荐使用NEB Bsa I-HF和配套的CutSmart Buffer。
? sgRNA表达盒构建方法1:
（2）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100 μM母液，各取1 μl加入到98 μl 0.5x TE混合稀释到1 μM。
约90℃ 30 s，移至室温冷却完成退火。
（3）sgRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒各1 μg，在25 μl反应用10 U Bsa I酶切20min，冷冻保存。
关键点：不要用太多酶和太长时间过度酶切！
（4）sgRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应： 成分
10×T4 DNA ligase Buffer pYLsgRNA-U#质粒 接头
T4 DNA ligase(Takara) ddH2O
加入量 1 μl 0.5 μl 0.5μl 0.05 μl
补足到 10 μl
终浓度(量) 1×
10~20 ng 0.05 μM ~18 U
室温（20-28℃）连接约10-15 min
关键点：过多DNA ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV &V。
注：不同公司的T4 DNA ligase单位的定义和标定单位不同，如Takara的350U/μl，NEB的400 U/μl，但绝对活性单位/μl都接近，即每10~15 μl反应大致使用0.05~0.1 μl酶。
上述步骤（3），（4）酶切和连接二步反应可用一步酶切-连接反应（边切边连法）替代：
配制10 μl 1x Bsa I酶切连接（Restriction-ligation）反应液：在1x Bsa I-酶切Buffer中加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM（此buffer对Bsa I和ligase都有效），加入约10~20 ng pYLgRNA-U#质粒（预先配好20 ng/μl保存），0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM），3~5 U Bsa I，~15 U T4 DNA ligase。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.5-1.0 μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此优先用NEB的）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不适合Bsa I酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37℃ 5 min，20℃ 5 min。
（5）第一轮扩增：每个sgRNA表达盒分为2个PCR反应，各15 μl反应体系：取0.5 μl连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向引物/gR-R（反应2），各0.2μM,适量高保真PCR酶。25-28循环：94℃ 10s，60℃ 15s ，68 ℃ 20 s。(任意) 取4 μl电泳检查（反应2产物长度约140 bp，用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。
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