注：虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见Figure 4。
关键点：最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KOD FX。不要使用能在产物3’附加A碱基的DNA聚合酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。
（6）第二轮PCR：
按附录1通用引物所述，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 μM： 引物组合
1个靶点：PT1R；
2个靶点：PT1，PT2R； 3个靶点：PT1，PT2，PT3R;
4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4R;
5个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5R;
6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6R；
7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7R； 8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，PT8R
取第一轮PCR产物1 μl用H2O稀释10倍，各取1 μl混合为模板。各表达盒20-50 μl PCR (1个靶点50 μl； 2-3个靶点各30 μl；4个或以上靶点各20 μl)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15 μM）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。
扩增17-20循环(实际情况调整)：95 ℃ 10s，58℃ 15s，68 ℃20 s。 取2 -3 μl电泳检查产物长度是否符合（注1），并估计样品的大致浓度。
注1：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为Bsa I切后）：
单子叶表达盒
PCR扩增产物长度（bp）
BsaI酶切后长长度（bp）
双子叶表达盒
PCR扩增产物长度（bp）
BsaI酶切后长度（bp）
LacZ-OsU6a-gRNA OsU6a-gRNA OsU6b-gRNA OsU6b-gRNA LacZ-OsU3-gRNA OsU3-gRNA
831 629 515 924 766 603
801 599 485 894 736 573
LacZ-AtU3d-gRNA AtU3d-gRNA LacZ-AtU3b-gRNA AtU3b-gRNA AtU6-1-gRNA AtU6-29-gRNA
486 284 709 507 487 502
456 254 679 477 457 472
（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化。 关键点：此步骤是为了除去DNA聚合酶，以防止下面步骤Bsa I酶切产生的粘性末端被补平。
? sgRNA表达盒构建方法2 (Overlapping PCR):
（8）取2-5 ng pYLgRNA-OsU#质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：U-F和gRT#+ 各0.2 μM，U#T#-和gRT#+（Table S1）各0.1 μM。25-28 循环：94 ℃ 10s，58℃ 15s ，68 ℃ 20 s。 在扩增过程中，开头的若干循环时U-F/U#T#-扩出U#--T#序列，gR-R/gRT#+扩出T#--sgRNA序列。后期的循环中通过overlapping PCR产生2个片段合并的sgRNA表达盒片段。
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(9) 取第一轮PCR产物1μl用H2O稀释10倍，取1 μl为模板，按以上步骤（6）进行第二轮PCR。
? 组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体 (策略I, Golden Gate cloning)：
(10) 双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应
试剂
10×CutSmart Buffer 10 mM ATP
pYLCRISPR/Cas9质粒 sgRNA表达盒混合物 Bsa I-HF
T4 DNA ligase H2O
加入量（μl） 1.5 1.5
60-80 ng
每表达盒10-15 ng 10 U 35 U
最终15μl
终浓度 1× 1 mM 4-6 ng/μl
0.1-0.2 U/μl 2-3 U/μl
注：每个靶点约10-15 ng (如1个靶点约10 ng、 2个靶点共20-30 ng、 3个共约40-50 ng、 4个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15 ng/片段）。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6。
用变温循环进行酶切连接约10-15循环: 37℃5 min；10℃5 min，20℃ 5 min；最后37℃5 min。此方法简便效率高，阳性克隆率高，推荐优先使用。冷冻保存未用完的连接产物，有必要时做下一步扩增用。
注：也可以用常规的先切后连法（供参考）：
取约2-3 μg pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在50 μl（30U BsaI）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）（不要用太多酶或太长时间过度酶切）。用0.5x TE洗回收胶30分钟，65 ℃ 3 min熔解，在40 ℃加入Agarase（1U/100μl胶， NEB)处理30分钟后，分装成每管40-60 ng（2-3 μl）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。
在切好分装（步骤2）的pYLCRISPR/Cas9 (约60-80ng）管中，加入已用Bsa I酶切好的PCR产物（每个靶点约10-15 ng），在10 μl 连接反应（加35 U连接酶）， 16 ℃（或最好用变温循环: 10 ℃ 5min，20℃ 5 min；10-15循环）连接2-3 h（不要过长时间连接）。
? 连接效率低的补救方法：
（11） 如果连接较多（4个或以上）的sgRNA表达盒的效率低,即连接产物直接转化后不能获得阳性克隆，就用步骤（10）的0.2-0.5 μl连接产物为模板(直接转化得不到阳性克隆的连接产物也可以作为扩增模板，因为很少的连接分子就足够被扩增了)，以Table S1的引物PB-L/PB-R扩增（40 μl，用KOD FX）(如果使用旧说明书的位置特异引物，PB-L/PB-R要改为PB-Lo/PB-Ro (见Table S1说明)。为提高扩增特异性，用热启动：先不加引物，在反应温度达到80度以上时介入引物（最终0.2 μM）。10循环：97°C 10 s; 60°C 20 s; 68°C 3-5 min (延伸时间按40 s/1 sgRNA或 1 min/1kb) ;再15循环（循环数可调整）：97°C 10 s; 68°C 3-5 min。电泳回收目标片段（扩增产物可能会有非特异小片段）。取约20-30ng产物与50-60 pYLCRISPR/Cas9按以上步骤（10）再酶切与连接。
注：PB-L/PB-R位于双元载体与sgRNA表达盒的连接点(Figure 4)。
（12）连接产物转化（电激法）：将连接产物滴载在悬浮式透析膜Millipore VSWP04700（0.025 μm孔径）对0.2 x TE透析15~30 min（最好在4℃冷柜内）透析脱盐（注1）。取1-1.5 μl连接产物电激转化E. coli DH10B感受态细胞（注2），电激后加入1 ml SOC，37℃培养1-1.5 h。涂板培养基为LB+ 25 μg/ml Kan, 0.3~0.5 mM
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IPTG(注3)，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表达盒）的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑（注4）。 注1：或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5 μl 去离子水。
注2：化学热激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。虽
然其它菌株也可以用，但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养（不要用LB培养），以10 pg pUC18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯），要求达到效率>109 colonies/1μg pUC18(即电激10 pg质粒，涂1/20 转化细胞出500以上菌斑)。>15kb大质粒的电激电压为1500-1600 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯（或2500V/40μl感受态细胞/2μl电激杯）； 注3：使用Lac Iq基因型菌种用1.0 mM
注4：注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdBs功能
突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdB的空载克隆。
（13）提取质粒，Mlu I酶切电泳检测sgRNA表达盒连接片段。如果Mlu I酶切带型有疑问，用Asc I酶切确
认。（如果做以下步骤测序，可不做这个PCR检测）取少量（1~3ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：SP-DL引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；…如此类推，最后靶点正向接头引物与SP-R引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。
（14）测序检测(如果步骤13确认了，可以不做此测序)：利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点
进行测序。
pYLCRISPR/Cas9Pubi-SP-L1OsU6cT1T#RBSP-RT2pYLCRISPR/Cas9P35S-T3SP-L2 RBT1T2T3T#SP-R
Figure 8. Strategy for sequencing of the linked sgRNA expression cassettes
注：最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施。 注：由于OsU6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通OsU6c到靶序列（T#），如果OsU6c
是最后一个表达盒，要用SP-R (见第2页)进行测序；如果U6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。
（15）导入农杆菌。获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105）。在农杆菌的稳定性检测（可以不做）：从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR确认。
可选步骤：或将质粒转化DH10B，再挑取单克隆培养，并提取质粒酶切分析。
(16) 获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织。
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(17) 获得转基因T0植株的打靶效果检测：打靶成功的转化体往往在靶点产生单碱基插入或者缺失若干碱基。以靶点为中心，在两侧各离开约200-300 bp处合成引物PCR扩增。关键点：在靶点上游约150-250bp处设计内部引物为测序引物（这个距离的测序质量最好，但不要少于100bp和不要大于400bp），对PCR产物直接测序（不要用PCR扩增使用过的引物再次用作测序，会产生高水平杂信号）。如果从某个碱基以后全部是重叠峰峰，表明是杂合突变或双等位突变，可按基于Ma et al., 2015 (Mol. Plant 2015, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molp.2015.02.012)的DSD方法的Web程序DSDecode（http://dsdecode.scgene.com/）进行解码；如果测序峰图无重叠峰，也可以用DSDecode判定为野生型或纯合突变。
注1：拟南芥T1代有相当多嵌合突变和杂合突变，后代分离可能不符合孟德尔分离比，还会出现新的突变。
附录1
本附录列出了使用本载体系统所必需的部分材料。其它常规分子克隆需要的材料没有列出。
菌种：
大肠杆菌Top10F’，用于pYLCRISPR/Cas9系列载体的繁殖，如果我们已经提供了含有质粒的菌种，则不需
要准备。
大肠杆菌DH10B或DH5a或其他常用克隆用菌种，用于克隆载体； 农杆菌EHA105或者其他农杆菌，用于转化水稻，拟南芥等植物；
酶：
BsaI-HF (NEB, cat. no. R3535); Mlu I (TAKARA, cat. no. D1071);
KOD Plus (TOYOBO, cat. no. KOD-201); KOD FX (TOYOBO, cat. no. KFX-101);
Golden Gate克隆通用引物：
Table S1. Primers used for Golden Gate cloning of sgRNA expression cassettes.
Position 1st PCR 2nd PCR Site B-L Site 2 Site 2 Site 3 Site 3 Site 4 Site 4 Site 5 Site 5 Site 6 Site 6
Primer U-F gR-R Pps-GGL Pgs-GG2 Pps-GG2 Pgs-GG3 Pps-GG3 Pgs-GG4 Pps-GG4 Pgs-GG5 Pps-GG5 Pgs-GG6 Pps-GG6
Sequence (5’--3’)
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG CGGAGGAAAATTCCATCCAC
TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGtcttcacTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTaagacttTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGagtccttTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTgactacaTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGgtccacaTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTggactagTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGcagatagTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTtctgcaaTGGAATCGGCAGCAAAGG
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Site 7 Site 7 Site 8 Site 8 Site B-R Flanking Primers Pgs-GG7 Pps-GG7 Pgs-GG8 Pps-GG8 Pgs-GGR PB-L PB-R AGCGTGggtctcGacctcaaTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTaggtttcTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGagcgttcTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAggtctcTcgctgatTGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC GCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTATGG
GCGCGCggtctcTACCGACGCGTATCC （1）The Bsa I-cutting non-palindromic ends with the same color are compatible for ligation. （2）ACTAGTandACGCGTare Spe I and Mlu I sites, respectively.
（3）If more sgRNA expression cassettes are needed, new primer sets can be designed with distinct Bsa I-cleaving sites.
（4）Table S1的位置特异引物与旧说明书的引物相比，改了引物名并有少量修改。旧说明书的引物可以继续使用，但如果要PCR扩增连接产物，PB-L/PB-R要改为：PB-Lo: GGCGCGCgGTctcGCTCGACTAGTG-3’； PB-Ro: GCGCGCggtctcTACCGACGCGTCCA-3’。
Table S2. Primers used for introduction of target sequences into sgRNA expression cassettes by overlapping PCR.
Sequence Primer
(N19 or N20)gttttagagctagaaat-3’ (N19 or N20)Cggcagccaagccagca-3’ (N19 or N20)Caacacaagcggcagc-3’ OsU6bT#-
(N19 or N20)Ctgagcctcagcgcag-3’ OsU6cT#-
(N19 or N20)Tgccacggatcatctgc-3’ OsU3T#-
(N19 or N20)Tgaccaatgttgctcc-3’ AtU3bT#-
(N19 or N20)Tgaccaatggtgctttg-3’ AtU3dT#-
(N19 or N20)Caatcactacttcgtct-3’ AtU6-1T#-
AtU6-29T#- (N19 or N20)Caatctcttagtcgact-3’
gRT#+ OsU6aT#-
Note: For regular targets, use N19 (19 nucleotides) as the target sequences that do not include the first base G or A; for irregular targets, use N20 (20 nucleotides) as the target sequences. All gRT#+ primers have the same 3’ end sequence (gttttagagctagaaat-3).
策略II: 基于Gibson Assembly的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9的连接方法
Gibson 等开发了一种“isothermal in vitro recombination reaction”，也称为 “Gibson Assembly” 可进行多个PCR片段的连接(Gibson, et al., 2009; Gibson, et al., 2010; Gibson, 2011)。商业的连接克隆试剂盒“Gibson Assembly Kit” (NEB)就是基于此技术, Takara的In-Fusion 使用不同酶系，原理相似，也可以达到相同目的，但这些试剂盒很昂贵！（1500-1700元/10次反应）。本实验室利用自制的isothermal in vitro recombination reaction mixture (见以下，成本非常低)，可进行质粒载体的多个片段同时克隆和缺失（Jiang et al., 2013. One-step cloning of intron-containing hairpin RNA constructs for RNA interference via isothermal in vitro recombination system. Planta 238, 325-330; Zhu et al., 2014. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene 548, 39–42）。以下介绍基于Gibson Assembly的CRISPR/Cas9多靶点载体的构建。
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