微生物实验报告
微生物大小和显微计数
刘欣怡201100140057
生物科学基地班
组别：周一下午三组
同组者：曹平平，周楠，
刘艺，刘希伟
实验完成时间：2012年11月26号
一、实验目的
1、明确显微镜下用测微尺测定微生物大小与血球计数板计数的原理 2、增强对细胞大小的感性认识
3、学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术
4、了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板测定微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算 5、巩固无菌操作技术和显微观察技术
二、实验器材
1.菌种 ： 酿酒酵母 2.培养基：
酵母合成培养基（配方见后附） 3.溶液和试剂：
蒸馏水，孔雀绿染液，番红染液，95%乙醇，香柏油，二甲苯等
4.仪器及其他用具：
载玻片，盖玻片，镊子，酒精灯，显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，计数器，滴管，擦镜纸，玻片夹，电子秤，称量纸，双层瓶，洗耳球，吸管，试管，试管架，高压蒸汽灭菌锅，纱布，玻璃棒，接种环等
三、实验原理
1、测微尺测量大小 （1）、测微尺的构造：
显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成。 目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。
镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为 1mm 的直线等分成 100 个小格，每格长 10μm，专用于校正目镜测微尺。
两重合线间镜台测微尺格数X10 目镜测微尺每格长度（μm）＝
两重合线间目镜测微尺格数
（2）、球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示
2、显微直接计数法：
将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：
A
1mL菌液中的总菌数= 5 ×25×104×B=5×104×A·B
四、实验内容
第I部分实验：借助特殊的测量工具——显微测微尺（包括目镜测微尺和镜台测微尺），在光学显微镜下测量酿酒酵母的大小。
第II部分实验：利用血细胞计数板对如酵母等微生物单细胞悬液进行计数，最后得到活菌体和死菌体的总数。
五、实验步骤
1. 微生物大小的测定。 （1）目镜测微尺的安装
把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2）校正目镜测微尺
将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图1）。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。
由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。
两重合线间镜台测微尺格数×10
目镜测微尺每格长度（μm）= 两重合线间目镜测微尺格数
（3）菌体大小的测定
无菌操作取酵母菌并涂片，干燥固定（可以在酒精灯上轻轻过几次，稍稍加热）。制片后，对菌体单染色（本小组采用孔雀绿染色），水洗净后，干燥。
将镜台测微尺取下，换上细菌染色制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。
值得注意的是，和动植物一样，同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平
均值。
本实验中，在视野中找到形态大小最多的酵母菌，测量其长和宽，测量三个酵母菌的长和宽，然后取平均值。 2. 显微镜计数。
（1）制备酵母菌培养液。
（2）镜检血球计数板，观察并认识血球计数板。 （3）加样品：
血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。 （4）观察计数：
将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓或太稀，需根据观察结果重新调节稀释后再计数。一般样品稀释度要求每小格内不多于8个菌体（酵母菌观察计数时为一小格不多于8个菌体，细菌观察计数实验中为一小格不多于15个菌体，这是因为细菌的个体非常小）为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，计数应统一，芽体应全部作为菌体计数或全部不计。
本次实验中，只使用一个小室进行酵母菌的计数，其他实验中，多采用上下两个小室同时进行平行实验。
本次实验中，本小组的酵母菌培养液中酵母菌浓度比较大，在第一次计数观察中，看到一个小格中的菌体量很多，大致估计了一下后，直接用水稀释菌液5倍。操作为：先用滴管吸去1ml菌液置于一个干净的试管中，然后向这只试管中再加入4ml水，振荡混匀后即得到了稀释5倍的菌液。然后在进行血细胞计数板计数实验操作。 （5）清洗：
使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、自然干燥，放回盒中，以备下次使用。