用这些溶剂之前，可以先咨询柱子的厂商确保这些溶剂能与柱子的填料相容。硅胶基质的柱子通常来说都是相容的，但有机聚合物基质的柱子可能会在某些溶剂组合中膨胀或收缩，这样会影响其色谱行为。
当用前述的溶剂系列时，确保表三所提到的溶剂能与系列中的溶剂互混。对每个溶剂系统至少要冲洗20体积。由于有些溶剂系统黏性很大，冲洗的流速应该相应调整以确保不会超过泵压。用完胍或尿等溶剂侯，至少应该用40～50体积的HPLC级水来冲洗柱子。 对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。然而有一个分离小组的研究表明由某个小组做的污染后的柱子可以用500μL1％SDS溶液用1ml/min的流速清除下多肽合成产物。如果继续用从5％～95％含1％（v/v）三氟乙酸的乙晴梯度洗脱，可以恢复多肽的分离。 清洗反相柱的特殊技巧
有时候，用有机溶剂清洗污染柱子并不能成功。如果金属离子吸附在硅胶或键合相上这种情况更有可能发生。用鳌合剂如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）通过色谱柱时，含有很多金属离子的EDTA复合物能溶解他们。用完EDTA溶液后，分析者一定要用水完全冲洗柱子。如果样品含有离子化合物，变化pH可以使他们转为非离子状态，这样他们就可以被水－有机溶剂混合物洗脱下来。例如，强碱性物质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性物质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9，这个状态酸性物质处于离子状态。然而，要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。
要避免缓冲液或用缓冲液保存的柱子长菌，可以用普通家用漂白剂1：10或1：20来冲洗。在这之间至少要打50体积色谱纯的水。不能让漂白水通过检测器，因为漂白水会腐蚀检测池。避免溶剂瓶中缓冲液长菌，每次只取足够的缓冲液用，把没用的保存在冰箱里，添加0.1％叠氮化钠在缓冲液中，用缓冲液保存的柱子不能长期不用。
色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上。柱子因此被污染很难回复到起始状态，因此人们都认为任何用于离子对的柱子都会被破坏而且用于不能再用于普通的反相色谱。
Bidlingmeyer不同意这种观点，他认为用于离子对色谱苛刻的pH值会通过水解键合相和在酸性条件下（pH1-3）硬化硅胶或在高pH条件下（pH7-8）溶解硅胶使一些柱子的性质改变。要清除离子对试剂中的磺酸，他建议首先用相同的没有离子对的缓冲液（至少20体积）冲洗然后用没有缓冲液的流动相(在清洗过程中甲醇可能比乙晴更有效；如果是长链的离子对试剂，用四氢呋喃)。很明显，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。Bidlingmeyer和他的合作者证明了在C18柱子上用流动相浓度大于70％的甲醇，长链离子对试剂，SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟分离组的结果一致。硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子（默克公司，德国）可认为跟别的硅胶柱一样。 聚合柱子的再生
用来分离生物分子的聚合柱也会被污染也需要清洁。聚合材料的化学稳定性通常以作用力来衡量。事实上，很多厂家建议用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗。一些反相聚合柱如用聚（苯乙烯－二乙烯基苯）（PS－DVB）小球和聚合单体如CIM RP－SDVB片（BIA分离，Ljublijana，前苏联）和Swift柱子（Isco，Lincoln，Nebraska，美国）能耐宽的pH范围（通常pH11～13或有时pH0～14），但使用者用强有机溶剂冲洗柱子时要注意。由其交联度决定，当柱子用某些有机溶剂冲洗时就会膨胀或收缩。高于8～10％交联度的聚合物通常有较好的机械性能在水溶液中收缩很少在有机溶剂中膨胀也不大。用一系列溶剂洗聚合
柱子之前最好能咨询生产者或技术支撑部门。
根据BIA分离，使用者可以再生聚合PS－DVB整体柱通过下面的方法： 含0.1％三氟乙酸的2－丙醇在一半工作流速下冲洗10个柱体积以上 100％流动相B在工作流速一半的条件下冲洗5个柱体积以上 用100％流动相A在工作流速下至少平衡10个体积以上
如果要含有丁基和乙基化学物质甲基丙烯酸酯基质的整体柱要清洗，沉淀的蛋白质可以通过按顺序反向冲洗10个柱体积的1.0M氢氧化钠、水、20％乙醇溶液和工作缓冲液来清除。如果有很多疏水蛋白质，使用者应该在水以后插入一个30％异丙醇或70％乙醇的步骤。 如果要清洗或灭活微生物菌落，PS－DVB可以用0.5～1.0M的氢氧化钠完全清洗。整体柱在室温下至少要用氢氧化钠洗一个小时。
用传统聚合基质装填的柱子来分离一些溶解度很小的蛋白质如膜蛋白、结构蛋白、和病毒外壳蛋白等需要用较强的清洗条件。例如含3M盐酸胍的50％异丙醇溶液在60℃才能把这些蛋白质除去。
在固相树脂中去除合成肽能产生重新激活被苯甲醚和苯硫基甲烷清除的正离子。清除正离子反应产生了大的芳香族分子，这些芳香族分子会在肽纯化时污染柱子。这种污染物在C18柱子上有非常高的保留没法被100％的甲醇或乙晴洗出。要清洗这类柱子，必须把柱子反向用5体积100％异丙醇，三到五个体积二氯甲烷，然后三到五体积异丙醇，最后到初始溶剂系统。芳香族不纯物的洗脱可以通过260nm紫外检测。 氧化锆基质HPLC柱子的再生
ZirChrom Separations，Inc.（Anoka，Minnesota，USA）生产了一系列的氧化锆基质柱子。该产品系列有几种反相柱子，包括聚丁乙烯，聚苯乙烯和游离碳版本。氧化锆比硅胶柱子的pH耐受性要好，所以涂上氧化锆能够耐受更苛刻的条件如高pH和操作温度。然而，因为其特殊表面性质，分析者应该保持一定的实验条件用于成功分析各种分析物。羧酸，氟化物和磷酸根离子都在氧化锆柱子上有强吸附。要清楚这些物质，应该用20％乙晴－0.1M氢氧化钠或0.1M四甲基氢氧化铵混合物冲洗50个柱体积，10体积水，50体积20％乙晴－0.1M硝酸混合物，10体积水，最后是20体积100％有机溶剂。对于聚丁乙烯和聚苯乙烯柱子，色谱操作者可以用甲醇、乙晴、异丙醇、或四氢呋喃。而游离碳柱子至少要用20％四氢呋喃。
反相柱子会因为重复注入含有强保留物质特别是分子量大的或疏水的样品而被污染，生物流体成分如蛋白质和强碱性物质可以吸附在硅胶介质上。另外，某些流动相添加剂如离子对试剂和表面活性剂能吸附在装填表面而改变他们的性质。被污染的柱子会导致峰形差，保留行为重复性差，高反压，和基线漂移等现象。通常，用有机溶剂或者是能够破坏污染物与键合相或硅胶表面的试剂能够清洁这些柱子。
色谱工作者在使用这种有腐蚀性或对键合相有破坏作用的试剂时要注意。此外，利用样品准备工作可以尽量减少柱子与不受欢迎物质的接触从而减少污染。对所有操作我觉得应该使用保护柱来避免对分析柱污染。 HPLC对流动相的基本要求 HPLC对流动相的基本要求： ①不与固定相发生化学反应。
②对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围）。k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀。
③必须与检测器相适应。如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。 ④粘度小。
高 效 液 相 色 谱
我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法 项目 鉴别 HPLC法 检查 含量测定 数量 1985年版 7 1990年版 9 12 60 1995年版 34 40 117 2000年版 150 160 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论
一、液相色谱理论发展简况
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点：
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类
按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又
称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。） 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 固定相极性 流动相极性 组分洗脱次序 正相色谱法 高～中 低～中 极性小先洗出 反相色谱法 中～低 中～高 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 被分离组分在柱中的洗脱原理
?色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
?基线(baseline)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
?噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
?漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ?色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。
?拖尾因子(tailingfactor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
?峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
?峰高(peakheight，h)——峰的最高点至峰底的距离。
?峰宽(peakwidth，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ ?半峰宽(peakwidth at half-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ ?标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ?峰面积(peakarea，A)——峰与峰底所包围的面积。A＝×σ×h＝2.507σ h＝1.064Wh/2h 2．定性参数（保留值）
?死时间(deadtime，t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
?死体积(deadvolume，V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱