出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
?保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 ?保留体积(retention volume，VR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR
?调整保留时间(adjusted retention time，t'R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)——扣除死体积后的保留体积。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R 3．柱效参数
?理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N＝()2＝16()2＝5.54()2
N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。 ?理论塔板高度(theoretical plate height，H)——每单位柱长的方差。H＝。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H＝，H有效＝。 4．相平衡参数
?分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K＝。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数 （或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 ?容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。k＝。因此容量因子也称质量分配系数。
分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'R＝kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的
几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。
?选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α＝＝ （设k2＞k1）。因k＝t'R/t0，则α＝，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。
要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5．分离参数
?分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R＝。当W1＝W2时，R＝。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。 ?基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系： R＝××
其中称为柱效项，为柱选择性项，为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。
从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。 二、塔板理论
1．塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：
1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。 4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。 2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A） 根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述： C＝e 或 C＝e
由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时，浓度C有极大值，Cmax＝。Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成
正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由流出曲线方程对V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax＝C0。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。 三、速率理论（又称随机模型理论） 1．液相色谱速率方程
1956年荷兰学者VanDeemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。
后来Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）： H＝2λdp＋＋\\s\%up5(2p＋\\s\%up5(2p＋\\s\%up5(2f 2．影响柱效的因素
1）涡流扩散（eddydiffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A＝2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A＝0。
2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u＝2γDm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1。
3）传质阻抗（masstransfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。
②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。
Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。
③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸
附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。 3．柱外效应
速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即： σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它 柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。
柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。
III．HPLC系统
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
II．基本概念和理论 一、基本概念和术语
最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。
目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。 一、输液泵
1．泵的构造和性能
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封
性能好，耐腐蚀。
泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400 kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。 各品牌输液泵的基本参数： 项目 流速范围 调节精度 流量精密度 流量准确度 最高压力 密封圈寿命 Waters 515型 HP 1100型 0.001~10 0.001 RSD 0.1% 4000 Psi 0.001~10 0.001 40 MPa LC-10ATvp型 Elite P200 II型 检定要求 0.001~9.999 0.001 ±2.0% 39.2 MPa 0.01~4.99 0.01 0.5% 40.0 MPa 1.5% 0.15%（<0.3%） 0.3% 流动相的脉冲 2．泵的使用和维护注意事项
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：
①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2μm或0.45μm）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 ⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。
如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：
①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。
②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。
③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。