实验四 果树有性杂交技术
一、目的和要求
果树有性杂交是创造果树新类型的主要方法之一，本实验是通过品种间杂交的实际操作，掌握果树的有性杂交技术。
二、材料和用具 材料：桃、葡萄、苹果。
用具：镊子、小剪刀、纸牌、透明纸袋、授粉器或毛笔、细棉纱线或回形针、干燥器、指形管、棉花、酒精（70%）、红漆。
三、有性杂交技术 （一）桃树
1．桃的花器结构及开花习性
桃树花为完全花，通常有花萼5枚，花瓣5枚，雌蕊1枚，雄蕊多数成三轮着生，花梗很短，花托成杯状，花萼、花瓣及雄蕊着生于花托上，雌蕊与雄蕊的长短依品种而不同，桃花芽为纯花芽，着生在一年生新梢上，江苏一般3月下至4月上开花，在一株树上开花初期到盛花期大致经过5～7天，这是授粉的最适时期。
桃的绝大多数品种是自花能实，因此，在杂交前必须去雄。 2．杂交技术
（1）亲本植株和授粉花枝的选择和处理
杂交前必须慎重地选择亲本植株。所选择的植株，树龄最好10～15年生，应当发育良好，在栽培上应给予特殊管理使它们在生长期内新梢长度能达50～60厘米，叶片健康无病虫害，杂交时最好选用长果枝上的花，其次是中果枝，多复芽而充实的枝条座果好，着生在树冠中部和上部的花比在树冠内部和下部的花可靠而又座果好，一般以在长果枝上杂交4～5朵花能结2～3个果为原则，中果枝上杂交3～4朵花，杂交用花最好在枝条上有一定间隔，同一枝上不作杂交的花应该除去。
（2）去雄与套袋
除去母体植株花朵中还未成熟花药的操作叫去雄。去雄的目的是为了避免自花授粉，去雄通常在开花前1～2天，即花苞达最大而花瓣尚未裂开时进行。操作时左手握住去雄花的花梗，右手执着镊子小心的拔开花瓣使雄蕊露出，而后夹去带有花药的花丝；应该避免触破花药和触伤雌蕊。如发现花蕾内有虫或个别花药已裂，说明柱头有可能已接受其它花粉或本身花粉，则应去除不用。
为避免去雄后的花朵天然杂交，在去雄后应立即套袋隔离，袋内要留有适当空隙，使花朵生长良好，袋自上而下套入，袋口用曲别针或细麻线缝在结果枝上，
10
并挂上纸牌。
套袋最好采用“袖筒式”套在整个果枝的中央，袖筒大小为27.5厘米×9.0厘米，1张报纸做8个袋，也有单个花朵用一个纸袋的。
（3）花粉的采集和保存
采集父本花粉的花朵应在花蕾期，花将开放而花粉尚未从花药撒出时摘去花朵，带入室内在光滑的纸上挑出花药，当气温升高花粉撒出时采集在花粉瓶内，并写明品种及采集期。花粉瓶放在干燥器内备用。为加速花药开裂，可将花药置于培养皿内，直接放入干燥器。
（4）授粉 通常在去雄后1～2日雌蕊成熟期授粉，授粉最适宜时间在上午9～11时进行。授粉时，首先将套的袋解开，用授粉器沾花粉在柱头涂之，授粉完毕立即套袋隔离，以免其它花粉落入。
（5）去袋 授粉后雌蕊柱头凋萎，花瓣谢落，子房开始膨大时（7～10天后），除去纸袋，以使幼果充分发育。
3．杂交后的记载和管理
杂交后对母本树应认真管理，给予良好的培育条件，按照杂交结实率记载表进行记载。
表1-1 有性杂交结果记载表 第一次检去 授 编号 组合 雄 粉 授粉查 第二次检查 结果数占授 粉花数（%） 果实采收 日果结果数占授 期 数 粉花数（%） 花数 幼果果实期 期 日期 日期 数 数 （二）葡萄
1．花器结构及开花习性
大多数葡萄的栽培品种是完全花，花很小，着生在复总状花序上（园锥花序），花冠绿色。上部合生，开花时下部与子房分离，向外卷曲成帽状脱落，雄蕊5～6个。在栽培品种中，除了完全花品种外，还有“雌能花”品种。这种花的雌蕊完好，有正常受精能力，而它的雄蕊花粉通常是不育的，没有受精能力。
葡萄花芽为混合芽，着生在结果母枝的叶腋，枝条的中下部叶腋芽能形成花芽，但以基部3～8节形成的花芽最佳，在结果枝上应选择下部的花序供杂交用。
新梢下部的花序比上部花序开放早。花蕾一般在上午6～11时开放，以9～10时开放最多，一个花序的花期约3～5天，柱头花蕾开放后4～6天内有受精能力。
11
2．杂交技术
（1）花粉的收集和贮藏
一般收集葡萄花粉是在晴天的早上，采摘刚开而未经昆虫访问过的父本花序，在室内用镊子取下花药，这种方法对花的收集较为经济，但较费事；另一方法是用透明纸袋直接套在未开的父本花序上，待花盛开时，用手多次震动花序，花药，花粉即落至透明纸袋内。
花粉收集以后，将它们放在吸水能力强的纸上，清除其中的花丝，待花药稍干后，再将它们倒入小瓶或指形管中，用棉花塞好瓶口，贴上注明品种和采收日期的标签，放在干燥器内，置于0℃～10℃的低温条件下保存。
（2）去雄和套袋
供杂交用的花序应选择发育良好，着生位置适中的花序。通常在一个发育充实的结果枝上生长着两个以上的花序，最好选用枝条下部发育良好的花序，除去上部花序。由于葡萄是无限花序，一个花序上的花数一般可达200～1500朵。因此，一穗上开花前后不一致增加了杂交的困难，影响果实发育，所以在选定花序后，一般剪去整个花穗尖的1/4和付穗，每个花序保留100～150个花蕾供杂交用，修剪花序后，当有少数花已开放，要进行疏花疏蕾工作，留下那些大致能在同一天开放的花蕾。疏穗后应随即去雄。最适去雄时间是开花前2～3天，这时花蕾已互相分离而肥大。颜色为黄绿色。花瓣和花盘已完全分离，只用镊子在花蕾的顶端一夹，花瓣和花药即可除去。去雄后，应检查有无遗漏的花蕾或残存的花药，然后套上准备好的透明纸袋，扎紧捆绑在结果枝上。
套袋用的透明纸袋大小一般长26厘米，宽14厘米。 （3）授粉
去雄后2～3天即可进行授粉，这时母本花序的柱头上分泌有大量的粘液，表示子房已能接受花粉，而且给花粉创造了良好的发芽条件，是授粉的最适时机。授粉宜在晴朗无风的上午8～10时进行。
少量花序授粉可用授粉器或毛笔蘸花粉授粉；大量花序进行授粉时可将花粉放在透明纸袋内，套到去雄的花序上，用手指从纸袋外面向花粉集中处弹2～3下，于是花粉便在纸袋中飞扬，约经半分钟，使花粉均匀的落在每朵花的柱头上以后即可取出；也可用小型喷雾器，当手压橡皮球时，将瓶内花粉喷在柱头，授粉后立即套好纸袋挂上标签，标明亲本和授粉日期。
授粉10天后拆除纸袋，将布条扎在授粉花序上，半月后可进行杂交结实情况的检查。
（三）苹果
1．花器结构及开花习性
12
苹果的花芽为混合芽，一花序中有花5～8朵，为伞房花序，一朵花具萼片、花瓣各5枚，花呈白色或淡红色，雄蕊15～20枚，雌蕊的花柱分裂为5，基部合一，子房着生于萼筒内，为子房下位花，子房内有心皮5个，每心皮有2个胚珠，受精后内胚珠发育为种子。苹果花期7～14天，每花序开放过程2～6天，中心花先开，渐及四周，称为离心开，多数品种中心花座果率高，开花的先后依次为老短果枝群，年青短果枝群，短果枝，中果枝，长果枝，最后是腋花芽。
2．杂交技术
（1）花粉的采集和保存 采集父本花粉的花朵应在大花蕾期，采后带入室内，放在光滑的纸上，取下花药，当气温升高花粉散出时，装入花粉瓶内，瓶上写明品种及采集期。在湿度较大的地区，花药应放入干燥器内或在室内加温促使花药开裂，采集花粉。然后贮藏在干燥器内备用。
（2）去雄和套袋 选择着生在植株上部光照和通风良好部位的花朵。通常在花蕾开裂前1～2天，将每一花序只留2～3朵较好的花蕾进行去雄，操作时左手握住花梗，右手用镊子拨开花瓣露出雄蕊，挟除花药，去雄时要避免触伤雌蕊，如不慎触破花药，花粉散出，应将花蕾摘除，镊子需在酒精中洗涤，干后再用。去雄后当即套袋挂牌。
（3）授粉 通常去雄后1～2日雌蕊成熟时（柱头上分泌粘液）授粉，授粉工作最好在温和无风的上午9～11时进行，授粉时先去袋，然后用授粉器将花粉涂于母本的柱头上，授粉后仍套上纸袋，并在纸牌上加注父本品种、授粉花数、日期和姓名。
授粉后1～2周，子房开始膨大时除袋，使幼果充分发育，去袋时检查杂交座果率，6月生理落果后（五月下至6月初）进行第二次杂交座果率检查。
3．杂交后的记载管理同桃。 四、作业
1.检查杂交结实情况及果实成熟后采收杂交果实和种子。 2.简述如何提高杂交结实率？
13
实验五 化学诱变染色体加倍及其鉴定
一、目的 学习应用秋水仙碱诱变园艺植物染色体加倍的操作技术，以及掌握染色体倍性鉴定的常用方法。
二、材料和设备 黄瓜种子以及幼苗；秋水仙碱、二甲基亚矾（DMSO）、聚乙二醇（PEG）；蒸馏水，小滴管，50ml量筒，100ml容量瓶，卷尺、放大镜等。
三、说明 应用化学诱变剂诱导植物产生变异，进行选择育种的方法是化学诱变育种。化学诱变育种分为两类，一类是诱导产生多倍体，常用的试剂是秋水仙碱（Colchicine）；另一类是诱发基因突变或染色体断裂，如甲基磺酸乙酯等烷化剂。前者的应用较多、较广泛。
秋水仙碱是从百合科植物秋水仙中提取出来的植物碱，极毒，易溶于冷水和酒精中。用于园艺植物诱变育种的秋水仙碱的有效浓为0.1%～1%，以0.2%最有效。秋水仙碱诱变是通过阻断纺锤体的正常形成，使染色体不能分离而导致加倍。由于有效诱变只发生在细胞分裂状态活跃的细胞、组织，所以常用萌动或萌发的种子、幼苗或生长旺盛的茎尖作为诱变材料。二甲基亚矾（DMSO）具有改善细胞膜的透性，可以促进植物对秋水仙的吸收；聚乙二醇（PEG）可以提高细胞的渗透压，利于细胞吸收秋水仙，因此，它们常被用作秋水仙诱变的增效剂。
四、方法及步骤 1、药剂配制
可以先用少量酒精溶解秋水仙粉剂，然后定容到所需的浓度；或直接用冷的蒸馏水配制。实验设计的浓度为0.2%和0.5%。秋水仙羊毛酯剂，不同浓度的秋水仙水溶液3～4，羊毛脂6，充分搅匀，到看不见游离的水溶液为止。
2、诱变
①滴苗：在两片真叶刚吐出（两叶一心）时，分别用0.2%的秋水仙、0.2%秋水仙+1.5%DMSO、0.5%秋水仙、0.5%秋水仙+1.5%DMSO每天8：00和18：00滴生长点。为了减少秋水仙滴落和蒸发，可用脱脂棉置于生长点上，并在滴后遮盖遮阳网。连续处理5天。20天后，统计成活株和变异株。每种处理至少50株。
②浸种：用0.2%、0.5%、0.2%秋水仙+1.5%DMSO和0.5%秋水仙+1.5%DMSO的秋水仙碱分别浸渍（用湿纱布包裹种子）已经催芽尚未露白的种子6hr、12hr和24hr。每种处理至少50株。然后播种在营养钵中。1周后统计出苗株和变异株。
③四倍体的鉴定：在变异株中鉴定。本实验以间接鉴定为主，直接鉴定为辅。
14