嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
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生 命 科 学 系 食品科学与工程
2011年5月
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
摘要：本课题对运城盐湖嗜盐放线菌YL产纤维素酶酶学性质进行了研究。DNS法对菌株YL的酶活进行测定。研究表明，该纤维素酶在50℃-90℃范围内酶活性较高，最适反应温度为60℃，说明该酶具有耐热的特性；酶促反应的最适pH是8.0，且在pH 7.0-9.0维持相对较高的酶活性，表明该纤维素酶耐碱性较好；该酶在盐度5%-17%范围内相对酶活达70%以上，最适反应盐浓度为10%，表明该纤维素酶是耐盐酶，而不是嗜盐酶；金属离子Mg2+、Zn2+对酶促反应有促进作用，Mn2+、Ca2+对该酶促反应部分抑制，而Cu2+、Fe2+对该酶促反应完全抑制，说明该酶活性的发挥受金属离子的影响较大；在特异性酶抑制剂DPEC、PMSF的作用下，相对酶活力较高，说明该纤维素酶酶活中心可能不含组氨酸和丝氨酸；同时该酶在金属螯合剂EDTA-Na的作用下，酶活力偏低，表明该酶活性的发挥依赖某种金属离子的参与。本研究对于进一步研究和应用纤维素酶具有深远意义。
关键词：嗜盐放线菌；纤维素酶；酶学性质
The activity research of cellulase producted by halophilic
actinomycete YL
Yuan Xueyun
(Life Science College, Yuncheng University, Yuncheng Shanxi，044000)
Abstract: The research aimed to study the characteristics of cellulase, produced by halophilic actinomycete YL from salt lake in Yuncheng. Acquire the cellulose enzyme activities by DNS method. The research showed as follows: the cellulase had a relatively high enzyme activity between 50℃ and 90℃, and the optimal reaction temperature is 60℃, this stated that the cellulase is thermotolerant; the optimal reaction pH value is 8.0, and the cellulase maintained a relatively activity between pH 7.0 and pH9.0, this indicated that the cellulase is alkali-resisting; the enzyme keeped the characteristics of over 70% in salinity between 5% and 17%, and the optimal reaction salinity is 10%, this revealed that the cellulase was a salt-tolerant enzyme, not a halophilic enzyme; Mg2+ and Zn2+ could activate its enzyme activity, Mn2+ and Ca2+ could partly reduce enzyme activity, while Cu2+ and Fe2+ could completely reduce the enzyme activity, this stated that metallic ions had a great influence on the cellulase; Under specific enzyme inhibitors DPEC and PMSF, the enzyme activity is relatively high, indicated that the activity center didn’t include serine and histidine; Under the EDTA-Na the enzyme activity is low, showed that the cellulase delayed on metallic ions. The research have a far-reaching significance for further research and application of cellulase.
Keywords: halophilic actinomycete; cellulase; enzyme activity
目 录
第一章 引 言 ................................................................................................................................. 1
1.1运城盐湖简介 .................................................................................................................... 1 1.2嗜盐放线菌的研究与应用 ................................................................................................ 1 1.3纤维素酶国内外研究情况 ................................................................................................ 2 1.4纤维素酶的来源 ................................................................................................................ 2 1.5纤维素酶的应用 ................................................................................................................ 3 1.6本文研究的目的和意义 .................................................................................................... 3 第二章 嗜盐放线菌产纤维素酶活性研究 ................................................................................. 5
2.1 材料 ................................................................................................................................... 5
2.1.1 菌株 ......................................................................................................................... 5 2.1.2 试剂 ......................................................................................................................... 5 2.1.3 主要仪器 ................................................................................................................. 6 2.1.4 培养基与试剂配置 ................................................................................................. 6
a．培养基 .................................................................................................................. 6 b．试剂配制 .............................................................................................................. 7
2.2 方法 ................................................................................................................................... 7
2.2.1菌株YL产纤维素酶的鉴定 ................................................................................... 7 2.2.2 酶活测定 ................................................................................................................. 7
a．粗酶液的制备 ...................................................................................................... 8 b．葡萄糖标准曲线的绘制 ...................................................................................... 8 c．羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定 ................................................... 9 2.2.3 粗酶特性研究 ......................................................................................................... 9
a．温度对酶活的影响 .............................................................................................. 9 b．pH对酶活的影响 .............................................................................................. 10 c．NaCl浓度对酶活的影响 ................................................................................... 10 d．金属离子对酶活的影响 .................................................................................... 11 e．特异性酶抑制剂对酶活的影响 ........................................................................ 11
2.3 结果与分析 ..................................................................................................................... 11
2.3.1菌株YL产纤维素酶鉴定结果 ............................................................................. 11 2.3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究结果 ...................................................................... 12
a．温度对酶活的影响 ............................................................................................ 12 b．pH对酶活的影响 .............................................................................................. 13 c．NaCl浓度对酶活的影响 ................................................................................... 13 d．金属离子对酶活的影响 .................................................................................... 14 e．特异性酶抑制剂对酶活的影响 ........................................................................ 14
第三章 讨论 ................................................................................................................................. 16
3.1菌株YL产纤维素酶的鉴定 ........................................................................................... 16 3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究 ....................................................................................... 16 致 谢 ............................................................................................................................................. 17 主要参考文献 ............................................................................................................................... 18
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
第一章 引 言
1.1运城盐湖简介
运城地处北纬35.02，东经110.59，位于山西省西南部，北依吕梁山与临汾市接壤，东峙中条山和晋城市毗邻，西、南与陕西省渭南市、河南省三门峡市隔黄河相望。运城盐湖，史称河东盐池，解池。位于晋南盆地的最低处，它自东北西南延伸，长约30千米，宽约3千米-5千米，海拔324.5米，最深处约6米，面积132平方公里。运城盐湖是个古老而又典型的内陆咸水湖，地质研究表明，运城盐湖诞生于新生代第三纪喜马拉雅构造运动时期，距今约0.5亿年，到新生代第四纪，受到新的地壳变化作用，形成了狭长的陷落地带，再加上运城地区属温暖半干旱大陆性季风气候，大量含盐类矿物质汇聚在这里，经过长期的沉淀蒸发，逐渐形成了今天的运城盐湖。
1.2嗜盐放线菌的研究与应用
嗜盐微生物通常生活在盐湖、盐碱地、海水、晒盐场和盐渍食物等高盐环境中，属于极端环境微生物[1]。根据微生物生长对NaCl的需求和最适生长的NaCI浓度，Larsen(1986)和Vreeland(1987)将微生物分为四类：非嗜盐微生物(Nonhalophilic)、轻度嗜盐微生物(slight halophilie)、中度嗜盐微生物(moderately halophilic)和极端嗜盐微生物(extreme halophilic)[2]。表1-l列出4类微生物生长对盐的需求及耐盐范围。可见，中度嗜盐菌是指一大类生长离不开NaCl的、能够适应很宽的盐浓度范围的、庞杂的异源微生物生理类群。
表1-1 不同微生物的生长对盐的需求及耐盐范围
Fig.1-1 Microbial growth in different salt requirement and salt on the range
微生物种类 对NaCl的需求 NaCl浓度范围 最适NaCl浓度
非嗜盐微生物 不需要 >1%抑制生长 -- 轻度嗜盐微生物 少量需要 -- 1-3% 中度嗜盐微生物 需要 0.1-32.5% 5-10% 极端嗜盐微生物 需要 9-35% 20%
备注 中度嗜盐微生物与极端嗜盐微生物所处的环境是相同的
中度嗜盐菌因有极宽的耐盐范围，其分类特征、系统发育地位、渗透调节机制以及遗传学具有重要的基础理论研究价值。我国盐碱地面积广阔，通过对中度嗜盐菌的渗透调节机制的研究，以期分离出耐高盐的基因，转入植物体中，以获得耐盐农作物新品种，这将对我国农业发展有着划时代意义。
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