嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
基础培养基 + 1%的CMC-Na +（2%+0.5）的琼脂 b．试剂配制
(1) 3，5一二硝基水杨酸(DNS)溶液的配制[11]
A液：先用少量热水溶解185 g酒石酸钾钠，再定容至500 ml。
B液：取500ml大烧杯，称取DNS(3，5一二硝基水杨酸)6．3 g用少量的蒸馏水溶
解。配置2 mol/l的NaOH溶液，加262 mLNaOH溶液于DNS溶液中。将B液加入A液中，再依次加入5 g结晶酚、5 g无水亚硫酸钠，搅拌使其充分混匀，冷却后在容量瓶中定容至1000 ml，混匀后转移至棕色瓶中贮存，室温放置一周后使用。
(2) 1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取10mg分析纯的无水葡萄糖，用枪定容至10ml。 (3) 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0-8.0)
pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0.2mol/LNa2HPO4(ml) 4.11 7.71 10.30 13.63 16.47 19.45 0.1mol/L 柠檬酸（ml） 15.89 12.29 9.70 7.37 3.53 0.55 (4) 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.0)
pH 9.0 10.0 0.2mol/L 甘氨酸（ml） 50 50 0.2mol/L NaOH (ml) 8.8 32.0 注：配置好的溶液均加水稀释至200毫升。
2.2 方法
2.2.1菌株YL产纤维素酶的鉴定
用接种环将发酵液中的菌落转移到CMC-Na平板上，划线，37℃恒温培养4d， 1mg/ml刚果红染色1 h，然后1 mol/l的NaCl溶液洗脱。若在菌落周围形成透明圈的则证明嗜盐放线菌YL可产纤维素酶[12] 。 2.2.2 酶活测定
7
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
酶活定义[13]：在pH8.0, 50℃条件下，每分钟水解CMC-Na产生相当于1μg还原糖所需的酶量，定义为一个酶活单位，用U/ml表示。
酶活力U/ml=葡萄糖含量（μg）·稀释倍数/(30min·0.5ml)
a．粗酶液的制备
取于37℃下培养三天的摇瓶培养液，分装于离心管，然后在10000r/min转速下离心10min, 上清液即为粗酶液。
b．葡萄糖标准曲线的绘制
DNS(3，5-二硝基水杨酸)与还原糖一起沸水浴后可生成棕红色的氨基化合物，因还原
糖的含量不同其生成物的量也有差异，导致颜色深浅不一，通过其在540nm处的吸光度来判断生成物的量，进一步可换算成溶液中还原糖的量[14]。
方法：取8支试管，分别加入0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml
1mg/ml的葡萄糖标准溶液，均补蒸馏水至2ml，再加入1.5ml DNS试剂混合均匀，沸水浴加热5min, 取出用流动水冷却至室温，空白管溶液调零后，稀释三倍后于540nm波长处测OD值（表2-3），以OD540值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（表2-4）
表2-3 葡萄糖标准曲线OD值测定结果
Fig.2-3 OD value of the determination results of glucose standard curve 测定项目 含糖量(mg) 葡萄糖（ml） 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 DNS试剂（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 OD540值
0 0.315 0.723 1.128 1.416 1.565 1.799 1.917 8
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
2.52.01.5OD5401.00.50.00.00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖含量（mg）
表2-4 葡萄糖标准曲线 Fig.2-4 Glucose standard curve
标准曲线的回归方程: Y=1.5432X+ 0.064 相关系数：R2=0.990442944
c．羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定
取pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液1.0ml，加入酶液0.5ml, 50℃保温30min, 沸水浴反应5min,流动水冷却至室温，用1.5ml的DNS试剂显色后，稀释3倍后测定OD值，OD值越大说明该菌株的酶活力越强[12]。 2.2.3 粗酶特性研究 a．温度对酶活的影响
取16支试管，按表2-5加入下列试剂，分别在温度30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下保温30min,用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值。根据OD值可知酶活大小。
表2-5
加入试剂 温度 30℃ 40℃ 50℃ 实验组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 粗酶液/ml 空白组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 蒸馏水/ml 9
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
60℃ 70℃ 80℃ 90℃ 100℃ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 注：表中CMC-Na缓冲液为pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液
b．pH对酶活的影响
取16支试管，按表2-6加入下列试剂，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值，可知酶活大小。
表2-6
加入试剂 pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 实验组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 粗酶液/ml 空白组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 蒸馏水/ml 注：表中的CMC-Na缓冲液为质量分数为1.00%的pH值与表相对应溶液的CMC-Na缓冲溶液。
c．NaCl浓度对酶活的影响
(1) 取16支试管， 8支分为实验组，8支为空白组，盐度（NaCl浓度）为2.0%的实验管与空白管分别加入0.5ml的粗酶液和0.5ml的蒸馏水，其它盐度（5. 0%、7.0%、10.0%、12.0%、15.0%、17.0%、20.0%）以此类推，操作一样，于50℃下保温1h。
(2) 再加入质量分数1.0%的pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液1ml，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值可知酶活大小。
10
嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
d．金属离子对酶活的影响
(1) 取14支试管，7支为实验组，7支为空白组，1号实验组与空白组试管均加入质量分数为10.0%的K+ 溶液1ml（其他6组同样加入质量分数为10.0%的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+ 溶液1ml），实验组各管均加入1ml的粗酶液，空白管相应的加入1ml的蒸馏水。
(2) 再取一支加有1ml的粗酶液和1ml的蒸馏水，以上15支试管均于50℃下保温1h，此后，从每支试管中取出1.5ml(即每支试管均保留0.5ml),另取一支加有0.5ml蒸馏水的试管。
(3) 向16支试管中均加入质量分数1.0%的pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值，可知酶活大小。
e．特异性酶抑制剂对酶活的影响
取5支试管，编号分别为1、2、3、4、5，按下表2-7进行操作:
表2-7
管号 2.0%PMSF(ml) 2.0íTA-Na(ml) 2.0%DPEC(ml) 蒸馏水(ml) 粗酶液(ml) 1 1 - - - - 2 - 1 - - 3 - - 1 - - 4 - - - 1 - 5 - - - - 1 50℃水浴保温1h，然后每支试管保留0.5ml
1.0%CMC-Na(ml) 1 1 1 1 1 1.5 1.5 1.5 60℃水浴保温30min DNS(ml) 1.5 1.5 沸水浴5min, 取出，流动水冷却至室温
然后于540nm下测定OD值，根据OD值，可知酶活大小。
2.3 结果与分析
2.3.1菌株YL产纤维素酶鉴定结果
11