嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究
嗜盐放线菌有关的应用研究主要集中在其产生酶的相关研究。嗜盐放线菌为了适应强大的渗透压而维持正的膨胀压，常在细胞内富集一些低分子量的无机复合物，可用于生物技术上生产调节剂。放线菌还能产生胞外多糖及其他聚合物，蛋白含量极高，同时也产生大量的抗生素、维生素等。他们具有的生理特征从而使其更具商业开发价值。
嗜盐放线菌在生物工程应用上的优势体现在：首先，大多数嗜盐放线菌能在高盐环境中生长，进而减少了生产中污染机会；其次，嗜盐放线菌相对于其它极端微生物多数易培养，大多可利用广泛的复合物作为唯一的碳源和能源生长；此外，嗜盐放线菌因其具有完善的遗传体系，故具有良好的工业化基础。总之，嗜盐放线菌具有广阔的应用前景。
1.3纤维素酶国内外研究情况
20世纪初，有人在蜗牛的消化道内发现了纤维素酶，很多学者便开始对纤维素酶进行研究。一个世纪以来，人们对纤维素酶的研究主要经历三个发展阶段。
20世纪50年代，主要是对纤维素产生菌种的分离筛选等，虽然当时已建立了一套菌种分离筛选方法，但只是对纤维素酶的基础研究。60至70年代，世界人口急剧膨胀，粮食短缺，为寻找新的食物来源，有研究者利用纤维素生产单细胞蛋白。期间，随着生物化学实验技术进一步发展，有学者对纤维素酶开始进行分离纯化，这一进展不仅加快了纤维素酶的研究步伐，更加促使工业上实现纤维素酶制剂的生产。70年代后，全球人口急剧增长，经继迅猛发展，能源短缺严重，与此同时，利用纤维素酶降解产物来开辟新能源成为研究重点。现今很多发达国家对纤维素酶的酶制剂实现了工业化生产，纤维素酶的应用价值日益凸显。
我国对纤维素酶的研究已有50年的历史，且在纤维素酶基础研究方面获得显著成果，同时还选育出一大批优良的纤维素酶产生菌种，在纤维素酶分子水品研究方面成果颇丰。此外，我国也致力于纤维素酶的应用研究，在纺织、洗涤、新能源生产、饲料、食品等方面取得了较大的进展。如今，我国已经是世界上四个能够生产纤维素酶的国家之一[3]。
1.4纤维素酶的来源
纤维素酶来源广泛，自然界中存在大量可以产生纤维索酶的微生物，真菌、细菌、放线菌等。以纤维素为食的反刍动物牛、驴等，其胃肠内就存在大量的产纤维素酶的微生物。还有一些昆虫，如白蚁的肠道也可产生纤维素酶。来源不同的纤维素酶其特点也不尽相同。
真菌产纤维素酶往往酶活较高，人们研究的最多，且产纤维素酶的真菌以丝状真菌为
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主，其中对木霉菌属的研究也最为透彻。
相对真菌而言，细菌产生的纤维素酶量较少，对纤维素的降解能力也较弱。但芽孢杆菌可产生碱性纤维素酶，这相对于真菌产生的酸性纤维素酶则具有较大的应用前景。 放线菌产纤维素酶的活力较高，且所产生的纤维素酶往往具有耐碱的特性。常见的可降解纤维素的放线菌有以下种类：链霉菌属、高温放线菌属和弯曲热单孢菌等[4-7]。
1.5纤维素酶的应用
纤维素酶应用很广泛，在纺织、洗涤、新能源生产、饲料、食品等方面都显示出了巨大的应用价值[8]。
纺织品的麻、棉等很多都是纤维素成分，如果用纤维素酶对其进行处理，使纤维遭到适度破坏，就可以使纺织品变得更加柔润，光滑，吸水性增强而且手感较好，这极大地满足了人们对于纺织品舒适度和美观度的需求，由此在国际纺织工业上得到了大力的推广和广泛的应用。
纤维素酶在洗涤行业也达到了大规模的应用。应用碱性纤维素酶对纯棉布料的去污变得简单方便，得到了人们的一致好评。
当今世界环境污染、能源短缺问题已经成为人们迫在眉睫解决的重大问题。若将纤维素作为新能源的原料来源，在纤维素酶的作用下将纤维素分解成可溶性糖类，再进一步转化为新能源乙醇，这对于缓解或解决人类的能源危机意义重大。
纤维素物质往往是很多畜禽的饲料之一，但一般仅局限于一些反刍动物具有消化纤维素的能力。若将纤维素酶作为纤维素类饲料添加剂，在纤维素酶的作用下，可将一部分纤维素分解为易于消化的糖类，利于牲畜的进食吸收，且易使其肥育。
当然，纤维素酶在食品领域也得到了大规模的推广应用。纤维素酶往往与其他酶类乳半纤维素酶、淀粉酶等协同作用，进而改造了食品的色度、味度、营养度和其他品质。
1.6本文研究的目的和意义
嗜盐放线菌不仅可以产生大量有重要意义的酶、聚合物等，而且因它们具有有用的生理特征而使其更具有商业开发价值，它可以使某些新的生物技术手段成为可能。
纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资源和能源。近年来，有关纤维素酶的研究报道较多，产菌种主要是曲霉、木酶的等真菌，然而这些菌种存在着产酶成本高、对碱稳定性不高、作用范围窄等问题。该研究从运城盐湖筛选分离出的一株产纤维素酶的嗜盐放线菌，其产生的纤维素酶具有良好的盐度稳定性和适应性，通过对此酶的活性研究，
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即在不同温度、pH、NaCl浓度、金属离子及酶抑制剂的作用下测定酶活的大小，以获得该纤维素酶反应的最适条件。若对其产生菌进一步诱变育种[10]，以提高其纤维素酶的酶活产量，这对于降低纤维素酶生产成本、推动生物乙醇的发展及促进运城工业的进程具有重要意义。
本实验为对运城盐湖嗜盐放线菌YL产纤维素酶酶学性质的研究，通过测定该纤维素酶在不同温度、pH、NaCl浓度及金属离子条件下的酶活力，可知该酶发挥酶活性的最适反应条件。此外，通过特异性酶抑制剂DPEC、PMSF和EDTA-Na对该酶的作用，可知此纤维素酶酶活中心组成，这对于进一步研究和应用该纤维素酶具有指导作用，也将促进运城盐湖微生物资源的开发和利用。
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第二章 嗜盐放线菌产纤维素酶活性研究
2.1 材料
2.1.1 菌株
采自运城盐湖泥样，经分离筛选，得到菌株YL。 2.1.2 试剂
表2.1 试剂一览表 Fig.2-1 Reagent list 试剂名称 硝酸钾（KNO3） 七水硫酸镁（MgSO4·7H2O） 碳酸钙（CaCO3） 磷酸氢二钾（K2HPO4） 氯化钾（KCl） 氯化钠（NaCl） 羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 一水硫酸锰（MnSO4·H2O） 七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 无水硫酸铜（CuSO4·5H2O） 氯化钙（CaCl） 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O） 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 柠檬酸（C6H8O7·H2O） 3，5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7） EDTA-Na(乙二胺四乙酸二钠C10H14N2O8Na2·2H2O) 可溶性淀粉 酸水解酪蛋白 规格 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生产厂家 天津汇英化学试剂有限公司 天津大茂化学试剂厂 天津瑞金化学品有限公司 西安化学试剂厂 天津市化学试剂三厂 天津大茂化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市化学试剂三厂 天津瑞金化学品有限公司 河北保定化学试剂厂 天津瑞金化学品有限公司 天津市泰兴试剂厂 天津市泰兴试剂厂 河北保定化学试剂厂 上海蓝季科技发展有限公司 天津瑞金化学品有限公司 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 5
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琼脂粉 PMSF(苯甲基磺酰氟C5H5CH2SO2F) DPEC(焦碳酸二乙脂C6H10O5) 刚果红（C32H22N606S2Na2） 酒石酸钾钠 亚硫酸钠 结晶酚 氢氧化钠 葡糖糖 异丙醇 注：实验中所用水均为蒸馏水。
分析纯 优级纯 优级纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 Amresco 0754 Amresco 0379 北京化工厂 天津市塘沽新化化工厂 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 2.1.3 主要仪器
表2-2 主要仪器一览表 Fig.2-2 List of major equipment 设备名称 电子天平 恒温水浴锅 离心机 恒温培养箱 摇床振荡培养箱 分光光度计 电热鼓风干燥箱 型号 AL204 HHS TGL-16G DNP-9052 HZQ-X100 UV1102 DAG-9070A 生产厂家 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司 天津华北实验仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 上海制造 上海精宏实验设备有限公司 2.1.4 培养基与试剂配置
a．培养基
(1) 基础培养基（淀粉酪素培养基）
KNO3 2g , KH2P04·3H2O 2 g，MgS04·7H20 0.05 g，NaCl 50 g，可溶性淀粉10g , 酪素 0.3g , FeSO4·7H2O 0.01g , CaCO3 0.02g , KCl 20g ,加蒸馏水至1000 ml，pH调至8.0, 121℃灭菌15-20min (2) CMC-Na固体培养基
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