天山雪莲质体果糖1，6-二磷酸醛缩酶家族基因在植物低温光合适应中的生理机制研究
果糖1,6-二磷酸醛缩酶在植物多个碳代谢过程中都起到重要作用。从前期雪莲低温转录组中发现，雪莲叶绿体中存在多达7个FBA基因的转录本，远超已知的其它植物。推测它可能以不同低温特性的混合同工酶形式应对雪莲生境中巨大的日温差变化。为了研究它们在雪莲低温光适应中的功能，本项目通过敲除质体FBA基因的雪莲突变体和过表达雪莲FBA基因的冷敏感植物番茄，采用气体交换技术对比分析它们在光合最适温度的响应。通过对转基因番茄碳同化过程中主要关键酶的活性、中间代谢产物和碳水化合物含量的动态变化检测，关联分析雪莲的FBAasec基因对不同低温下Calvin循环运转效率的影响。通过叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其对不同温度下的光合碳流量的控制效率。最后，通过转基因番茄间的两两互交，检验同工酶之间的协同效应和作用模式。
天山雪莲；果糖1,6-二磷酸醛缩酶；同工酶；低温光适应；生理机制
2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）
2.1 项目的研究目的
为了研究天山雪莲叶绿体定位的果糖1，6-二磷酸醛缩酶家族（sikFBAs）同工酶的多样性在应对高山生境日周期巨大温差变化中的生理机制，本项目通过CRISPR/Cas9技术，创建敲除雪莲叶绿体定位的sikFBAs的雪莲突变体和CaMV 35 S启动子或雪莲自身启动子驱动的sikFBAs基因在冷敏感的番茄中表达。采用气体交换技术比较它们在光合最适温度的响应（shift the optimum temperature of photosynthesis) 。通过检测转基因番茄碳同化过程中起重要调控作用的关键酶的活性、Calvin循环中的中间代谢产物和光合产物淀粉和蔗糖含量的动态变化，关联分析不同低温条件下，单个的雪莲sikFBAase酶对Calvin循环运行效率的影响。通过对叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其在不同温度下的光合碳流量的控制效率。在此基础上，通过转基因番茄的两两互交，检验雪莲sikFBAase同工酶间的协同效应和工作模式。本项目的研究对于揭示天山雪莲低温光合的生理机制和改良冷敏感作物的低温光合性能都具有重要的研究意义。
2.2 项目的研究内容
2.2.1 天山雪莲质体sikFBAs不同基因在低温光适应中表达模式分析
2.2.1.1 在不同温光组合和不同时间处理下，对天山雪莲幼苗叶片sikFBAs基因进行研究，确定sikFBAs不同基因间的表达变化特性。
2.2.1.2 根据sikFBAs基因非保守核酸区段，用双子叶植物的pP1C.1、pP1C.5的 CRISPR/Cas9载体配套载体，构建特异性的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体。
2.2.1.3 利用构建的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体，转化天山雪莲，利用PCR对转基因植株进行靶基因敲除检测，筛选已敲除目的基因的转基因突变植株，进行表型分析。
2.2.2 天山雪莲质体sikFBAs基因启动子的克隆和组织表达分析
2.2.2.1 通过反向PCR技术，克隆sikFBAs家族基因的启动子，利用生物信息学软件分析启动子序列。
2.2.2.2 用克隆的sikFBAs基因的启动子，构建sikFBAs基因启动子驱动GUS报告基因表达的融合植物表达载体。
2.2.2.3 用真空渗透法转化拟南芥，研究不同低温和不同时间处理下，拟南芥转基因株系PsikFBAs-GUS基因的温光响应和时空表达特性。 2.2.3 天山雪莲质位sikFBAs基因亚细胞定位分析和转基因植株的获得 2.2.3.1 构建组成型（CaMV 35S 启动子）驱动sikFBAs-GFP融合植物表达载体，用基因枪轰击洋葱表皮，激光共聚焦观察基因的表达。
2.2.3.1构建组成型（CaMV 35S 启动子）驱动sikFBAs基因植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化法，转化番茄，获得过表达目的基因的转基因植株。
2.2.3.2 用克隆的sikFBAs基因启动子和sikFBAs基因，构建自身启动子驱动的植物表达载体，根癌农杆菌介导转化番茄，获得可表达目标基因的转基因植株。 2.2.4 天山雪莲msikFBAs突变体蛋白质表达检测和最适低温光合温度的变化分析
2.2.4.1 根据sikFBAs蛋白氨基酸序列的可变区，寻找具有抗原表位的短肽，用于多肽抗体的制备并测定效价。构建sikFBAs基因的表达载体，制备并纯化
sikFBAs蛋白，利用Western blot检测免疫蛋白的特异性。
2.2.4.2 对获得不同msikFBAs敲除的雪莲突变体和正常雪莲，用不同温度和光照进行处理，提取蛋白进行表达量Western blot分析，确定不同的sikFBAase含量变化，同时对不同温度sikFBAase的总体酶活和总体比活性进行测定。
2.2.4.3 通过对正常雪莲和突变体雪莲气体交换参数的测定，研究光合指标与温度、光照因子的相关性，确定最适低温光合温度变化与酶活性变化间的协同性。
2.2.5 不同表达模式的转sikFBAs基因番茄在不同温光处理的表达分析
2.2.5.1在长期温度培养不同光照处理下，对组成型和诱导型表达sikFBAs基因的转基因番功茄叶片进行在转录水平和蛋白水平进行表达检测，分析基因和蛋白质的表达变化。
2.2.5.2 在长期温度培养不同光照处理下，对转基因番茄叶片表达sikFBAs基因的植株的酶活性和比活性进行分析，确定sikFBAs基因的转录、蛋白含量与酶活性变化的一致性分析。
2.2.5.3 测定转基因番茄叶片在不同温度气体交换参数、光合参数和叶绿素荧光参数，确定转基因番茄低温光合响应，分析最适温度变化与sikFBAs关联性。 2.2.6 转sikFBAs基因番茄对主要碳同化酶活性、代谢中间产物和光合产物积累的影响
2.2.6.1 通过不同温光处理，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄的Rubisco、Rubisco活化酶，SBPase， FBPase，TKLase以及蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性和比活性。
2.2.6.2 通过不同温光处理，采用HLPC，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄的Glc6P， Fru6P，Glc1P，3PGA，ATP，NDAPH和Pi含量。
2.2.6.2 利用C3植物的光合数学模型，对不同光温下的转基因番茄碳流量控制系数进行估算，并对单个sikFBAase贡献率进行综合分析。 2.2.7 sikFBAs间的协同作用分析和杂交基因番茄低温生长性能评价
2.2.7.1 通过不同温光处理，分析不同构建的转sikFBAs基因番茄营养和生
殖生长特性、生长动态及生长节律，研究不同构建的转基因番茄的生物产量并对
其进行评价。
2.2.7.2 利用不同构建的转sikFBAs基因的番茄，通过不同低温处理，对抗寒生理指标进行测定，关联分析光吸收、光合电子传递、碳同化间的能量分配，分析其与抗寒性的关系。
2.2.7.3 利用获得具有抗寒功能的转基因番茄，进行两两互交，对sikFBAs基因间的协同作用效果进行综合评价，并在自然低温条件下进行低温光合的适应性分析。
3. 拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）
3.1 研究方法
3.1.1 天山雪莲幼苗质体sikFBA基因低温表达模式分析
3.1.1.1 利用本实验室组织培养的新疆雪莲试管苗，生根移载至光照培养箱。以莲座叶伸展至5叶期（下同）的雪莲幼苗为对照，按20℃、15℃、10℃、5℃的顺序进行长期培养，每次处理0,2h, 6h 12h,18h,24h。不同温度处理下，测定天山雪莲幼苗的生长量。
采用大连宝生生物公司的植物RNA提取试剂盒提取各处理幼苗的总RNA。以新疆雪莲―管家‖基因GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）为内参、采用实时定量PCR技术对sikFBAs基因进行表达分析。
3.1.1.2 植物CRISPR/Cas9敲除载体的构建
用双子叶植物的pP1C.1、pP1C.5 CRISPR/Cas9载体配套载体（Genloci公司购置），根据定位于质体的天山雪莲sikFBAs家族基因，通过Blast核酸序列比对，选择非保守区设计一对20bp左右的oligo DNA引物，引物设计通过在线设计：ttp://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR。引物送华大基因公司合成，纯化级别为PAGE。使用Bbs I酶切pP1C.5（氨苄霉素抗性）载体，回收大片的片段；将正负链oligos（100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.5载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。 使用EcoRI、XbaI双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收目标片段；目标片
段与酶切纯化后的pP1C.1进行T4 DNA连接酶，连接，转化大肠杆菌， 得到重组载体pP1C.1。构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体，经测序验证。 3.1.1.3 天山雪莲突变体植株的获得
构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体，转化农杆菌 GV3101，叶盘法介导雪莲转化，经抗生素筛选获得再生植株，进行标记基因的PCR阳性筛选，同时检测目标基因是否敲除，获得有效的雪莲突变体植株，经组培扩繁，持续提供试验用苗。形成转基因株系在人工可控的人工培养箱内光周期12/12h生长，培养至5叶期，用于后续实验。（雪莲的转化参照本实验室方法，管岩岩，等.2010） 3.1.2 天山雪莲质体sikFBAs基因启动子的克隆和组织表达分析
3.1.2.1 根据天山雪莲sikFBAs基因序列，利用primer premier 5.0引物设计软件，在基因的近5’端设计2条反向引物，通过大连宝生物公司的Genome Walking kit克隆sikFBAs基因的启动子。利用基因启动子序列在线分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter)、(http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq -tools/promoter.pl)和(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/ proscan)，对启动子序列和可能结合的转录因子的基序位点进行分析。
针对启动子生物信息学分析结果，利用pBI211和pBI121质粒构建带有GUS基因的植物表达载体。转化根癌农杆菌GV3101，参照（Bechtold N，et al.1993.， Clough SJ and Bent AF，1998）方法，利用拟南芥真空渗透法转化拟南芥（Col-0），在温度和光照可控的植物生长室培育植株至结实，收获成熟种子。
参照王关林和方宏筠(1998)年的方法进行组织化学定位染色。根据拟南芥不同的发育时期（营养生长期与生殖生长期），在GUS表达活性最高的温度处理下，利用低温冷冻制片机，制备根、茎、叶、花、果实组织切片，用X-Gluc染色固定法，借助光学显微镜观察组织染色情况。
3.1.3天山雪莲质位sikFBAs基因亚细胞定位分析和转基因植株的获得 3.1.3.1 按照pAT7-EGFP植物表达的中间载体克隆位点（ 美国Arizona大学朱建康教授惠赠），根据天山雪莲sikFBAs基因序列，将其融合到pAT7-EGFP载体的EGFP的5’ 端，构建融合表达载体。然后将植物表达框构建到植物表达载体pCAMBIA 2300上，用于转化农杆菌GV3101。用基因枪轰击洋葱表皮，用