3.1.10.3 无机磷（Pi)测定：采用钒钼黄比色法（参照姚祖江，2010），待测液中的正磷酸与偏钒酸和钼酸能生成黄色的三元杂多酸，溶液黄色的深浅与磷酸含量成正比，生成物在440nm波长有吸收峰，故此可用比色法测定无机磷的含量。此法的优点是黄色稳定，对显色条件要求不十分严格，操作简便，干扰物少，灵敏度较低，作用范围随选用的吸收波长而异。 3.1.11 可溶性蛋白的测定和酶活的测定
3.1.11.1 叶绿体的制备
准备好试样，去除叶柄和中脉，同时用剪刀剪碎，准确称取4.17g，置于事先用液氮处理过的研钵，加入10ml预冷的STN缓冲液，迅速研磨或捣碎，使之成为匀浆，以四层纱布过滤去粗渣，滤液于低温（0～2℃）下，1500×g离心约5min。去除上清液，加入少许（0.3ml）STN（pH7.8）于沉淀中配成叶绿体悬浮液，待用。
3.1.11.2 可溶性蛋白的测定
按Bradford法进行测定：由300 μL已知浓度的BSA溶液与3mL考马司亮蓝G-250染液混匀，测吸光度 A595，从而绘制样品蛋白浓度与 A595值之间的标准曲线，并由此得到一个线性方程。取适量蛋白粗提液（上清液）稀释到 300 μL 与 3 mL 考马司亮蓝 G-250 染液反应后测得的A595值代入线性方程，即可计算出样品中可溶性蛋白的含量。
3.1.11.3 光合相关酶活性的测定 (1) FBAase酶活和比活性的测定：
在测酶活反应体系中加入已知浓度的果糖 1,6-二磷酸，5-25℃温育 1 分钟立即加入 875 μL 30%盐酸和 125 μL 的间苯二酚-硫脲试剂使终体积为 1.25 mL，80℃保温10 min，自然冷却至室温，测定 A520，绘制标准曲线。在测酶活反应体系中加入 上清液（反应起始），5-25℃温育， 1min立即终止反应，以零时反应（未反应就加盐酸终止反应）的反应体系作空白。测 A520的值。根据果糖 1,6-二磷酸的标准曲线计算出每分钟生成的 FBP 量，即为酶活性。FBA 酶的比活力：一定体积样品中的 FBA 总酶活性与可溶性蛋白总量、酶促反应时间相除，即 FBA 酶的比活力。
(2) SBPase 活性的测定（参考 Harrison 等，1998）的方法）：
取 0.1 g 叶片液氮研磨，加提取液，取 20 μL 上清液，加入80 μL 反应液 [2 mM SBP]，25 ℃反应5 min。加 50 μL 1.0 M 的高氯酸终止反应， 4 ℃ 离心取上清液 50μL加入 钼酸铵溶液， 25 ℃下反应10 min。再加入150 μL 孔雀绿溶液，25 ℃下显色30 min。620 nm比色，以 μmol·g -1 FW·s-1表示酶活性。
(3) Rubisco活性的和Rubisco活化酶活性测定：
Rubisco含量测定: 采用Yamori et al. (2005)方法。测定气体交换后，叶片被冰冻并贮存在?80 ℃，用于生化分析。冰冻叶片用液氮处理后，均质化后用提取液包括100 mM 磷酸缓冲液（PH 7.0）， 1.0% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮，0.1% (v/v) Triton X-100，1 mM 苯甲基磺酰化氟和1.0% β-巯基乙醇提取。采有Elisa方法测定Rubisco含量。鲜叶中Rubisco含量/mg·g-1由标准曲线计算的Rubisco浓度×稀释倍数/叶片鲜重。Rubisco活性测定采用C14标记法测定(李立人等，1986)。
(4) Rubisco活化酶活性测定：
FBPase( EC 3. 1. 3. 11) 酶活性测定:采用紫外分光光度计法。参照李合生(2000)，取40 μL 酶提取液加入 752 μL 预保温 30 ℃ 的反应液中，反应液组成为: 30 mmol·L-1酸钾( Hepes-KOH) 缓冲液( pH 8. 2) 、5 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1DTT、0. 5 mmol.L-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADP) 、2 U·mL－1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( G6PD) ( EC 1. 1. 1. 49) 和 2 U·mL－1磷酸葡萄糖异构酶( PGI) ( EC 5. 3. 1. 9) ; 加入 8 μL 300mmol·L－1果糖-6-磷酸( FBP) 启动反应． 用 UV-2450紫外分光光度计测定 340 nm 下 1 min 内吸光度值的变化，以此来计算 FBPase 的活性．(参照 Rao 和 Terry,1989) (5) TKL酶的测定：
根据Zrenner et al.（1993）; 100mMHEPES -KOH ，pH7.7 ， 12mM MgCl2， 200 μM硫胺素焦磷酸 ，0.8 mM木酮糖-5-磷酸， 0.8 mM赤藓糖-4-磷酸， 150 μM NADH，5U磷酸丙糖异构酶，2U甘油-3-磷酸脱氢酶，UGP酶。
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3. 拟解决的关键问题
确定一个酶活最佳的反应温度，最好的办法是直接提取和纯化这个酶，在体外通过不同影响因子研究其最好的酶催化反应条件。但是，从已有的文献分析，到目前为止，通过原核表达提取的酶几乎都没有活性，原因可能是定位于叶绿体的FBAase基因以同源四聚体的方式行使催化功能，对环境还是比较敏感的。 我们采用的策略是通过转基因方式来增强该基因表达或抑制该基因功能来间接评价它的酶学温度响应的动力学特性。生长于温带和寒带的许多植物，都有一种能够随着环境温度的变化，调节他们的最适光合能力，以提高光合生产效率。我们推测雪莲众多的FBAase同工酶在此可能起到重要作用。因为，预先存在不同温度适应的同工酶群体，能够在很宽的温度范围内发挥作用。如果敲除一个同工酶的基因，可能在某个温区会影响整个碳同化的整体运转。相反，如果将某个基因转化到冷敏感的植物中，就有可能增强在某个温区的光合效率。
因此，我们通过CRISPR/Cas9技术，敲除雪莲FBAase同工酶的其中一个基因，再通过不同温度处理，通过光合参数的测定，能够发现由于基因的缺陷而使雪莲在光合适应方面存在的温度敏感区。然后，再在这个温区内，通过过表达强启动子增加该基因的表达，就有可能在这个温区内增强番茄的光合能力。因为，
冷敏感植物缺乏这种光合温度的调节能力。那么，可以肯定这个温区就是这个同工酶温度适应区。
通过这种研究方法，我们就可以对所有定位于叶绿体的FBAase同工酶进行温度的敏感性分析，确定每个同工酶温度适应的有效范围，然后再通过转基因番茄互交，确定它们的协作模式，揭示它们工作的生理机制。 4. 可行性分析
植物在长期的适应性进化中，已经演化出许多抗逆的生理生化机制，以抵御不利的环境影响。起源于温带或寒冷地带的植物通常具有冷驯化和冻驯化的能力，来增强植物对低温的抗性。其中，耐冷性的植物能够调节最适光合温度，来提高它们的光合效率。对于光合系统而言，碳同化的过程受温度的影响最大，因为，低温对酶的活性影响最为直接。大多数植物可能通过增加酶的表达量，以弥补酶活的损失。但是，还有另一种方式，表达一种新的同工酶，以弥补低温对酶活性的影响。同工酶在植物中普遍存在，这种多样性的存在，能够增加生命系统的稳定性，增强植物对环境的适应能力。高海拔地区日温差的变化较大，这就需要很强的光合调节能力以适应温度的变化。采用同工酶多样性的形式，应该是一种很有效的调节方式。
果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物的碳同化、糖酵解、糖的异生等许多代谢过程中起重要作用。已有的研究已经证明，果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物的抗逆中也能发挥重要作用。我们认为，这与FBAase能够调节碳的流向有关。因为它的反应底物磷酸丙糖能够在细胞质和叶绿体内相互转运，直接联系卡尔文循环与糖酵解两个重要生化代谢过程。当RuBP再生受限时，可临时调节胞质中的磷酸丙糖，用于RuBP的再生，起到调节库的作用。已有的研究已经证明，它在很多的情况下，FBAase能够在碳流量的控制中起重要作用，尤其是在光合系统RuBP的再生受到限制时。转基因的研究也已经证明，当环境CO2提高时，它能极大的促进植物的生长。
因此，保证果糖1，6-二磷酸醛缩酶在植物中的正常功能，对于植物的生存非常重要。新疆雪莲是在高山环境中生长比较快的植物，它的分布区从海拔2400-3500m范围内都有分布，也与它的这种光合适应特性有关。新疆雪莲采用这种增加果糖1，6-二磷酸醛缩酶同工酶方式，对它的光合温度的适应性是有利
的。
天山雪莲要保持这种光合温度适应能力，就需要保证碳同化过程的碳流量的正常运转。目前，基因操纵已成为生理学家用来研究特定生物学过程中的代谢物或代谢途径的有力工具。这些通过反义植物技术，降低酶表达的响应可以揭示这个酶被除去多少能够影响代谢流量，从而能够估测流量控制系数。因而，我们可以采用敲除雪莲同工酶的方法和在冷敏感植物过表达雪莲同工酶的方法阻断或加强这个碳流量过程。然后，通过建立光合速率-温度响应曲线，在短时间内，通过分析温度响应曲线的波动，长时间内可用植物的最适光合温度适应性变化来评估这个同工酶在控制光合碳流量中作用。采用这个方法，我们可以对全部的同工酶进行分析，从而可以揭示雪莲质体定位的同工酶在雪莲低温光适应中生理机制。这种转基因技术在我们实验室已经很成熟，已有多年的技术积累，雪莲和番茄的转化体系已经很完备。
因此，本项目从理论上和技术上都是可行的。