激光扫描共聚焦显微镜(LSM 5 PASCAL)观察叶肉原生体细胞中EGFP的表达，观察物镜放大倍数为40倍，激发光波长为488 nm，带通BP 505-530 nm，长通LP 560 nm。确定EGFP是否是叶绿体定位。
3.1.3.2 在已构建的含有sikFBAs基因启动子的pBI121植物表达载体上，用酶切出GUS，用对应的sikFBAs基因替代，构建自身启动子驱的的植物表达载体，农杆菌介导番茄的转化，转基因再生苗，经PCR筛选阳性植株，获得可表达目标基因的转基因植株，用于后续实验。同样原方法，构建组成型（CaMV 35 S启动子）驱动sikFBAs基因表达的植物表达载体，并获得转基因番茄植株，组培快繁扩大株系，用于后续实验（下同）。
3.1.4 天山雪莲msikFBAs突变体蛋白质表达检测和最适低温光合温度的变化分析
3.1.4.1 根据sikFBAs蛋白氨基酸序列的可变区，寻找具有抗原表位的短肽，送百奇生物（ABGENT）公司合成15个左右的多肽，与蛋白偶联，免疫新西兰白兔，制备抗血清并测定效价。利用Western Blot检测目标蛋白的特异性。按照 Bradford（1976）的方法进行蛋白质定量分析。Western Blot按照标准方法操作（Sambrook 等，1989）。膜蛋白在 12%分离胶的 SDS-PAGE 分离，电转蛋白至硝酸纤维素膜，丽春红染色检验转膜效果。在5％的脱脂奶粉中封闭至少1 h，与sikFBAs1;5和sikFBAs2;7的抗血清（1 : 500）杂交2 h，然后与碱性磷酸酶交联的羊抗兔二抗（华美生物工程公司）（1 :1000）杂交1h，用 BCIP/NBT底物显色。
3.1.4.2 对获得不同msikFBAs敲除的雪莲突变体和正常雪莲，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下进行处理，提取蛋白进行表达量WB分析，确定不同的sikFBAase含量变化，同时对不同温度sikFBAase的总体酶活和总体比活性进行测定。
3.1.4.3 根据下面Gas-Exchange Measurements测定和分析方法，对雪莲和突变体的雪莲气体交换参数的测定，研究光合指标与温度、光照因子的相关性，确定最适低温光合温度变化与sikFBAase活性变化间的协同性。
3.1.5 不同表达模式的转sikFBAs基因番茄在不同光温处理的表达分析 3.1.5.1 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，对组成型和诱导型表达sikFBAs基因的转基因番茄叶片，提取总RNA，利用实时定量的方法进行表达分析。提取叶片的叶绿体蛋白，利用制备的特性抗体，采用Western Blot技术和ELISA技术，对目标蛋白水平进行表达检测。
3.1.5.2 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，提取叶片叶绿素和蛋白质，参照下面FBAase酶活的测定方法。确定sikFBAs基因的转录、蛋白含量。分析该基因在转录水平上是否与蛋白含量和酶活性变化相一致。
3.1.5.3 按照下面光合参数测定方法，测定转基因番茄叶片的不同温度气体交换参数、光合参数和叶绿素荧光参数，确定转基因番茄低温光合响应的模式，建立净光合速率光响应、CO2、室温响应曲线，SPSS软件进行三维拟合数据，分析最适温度变化与sikFBAase酶比活性的关联性。
3.1.6 转sikFBAs基因番茄对主要碳同化 酶活性、代谢中间产物和光合产物积累的影响
3.1.6.1 对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，提取叶片叶绿素，提取蛋白，采用下面酶活测定方法测定Rubisco、Rubisco活化酶，SBPase， FBPase，TKLase以及蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)活性和比活性测定。
3.1.6.2对获得不同转sikFBAs基因番茄，在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下培养处理14天，采用下面HLPC测定方法进行中间产物的Glc6P, Fru6P, Glc1P，3PGA，ATP，NDAPH和Pi含量的测定。 3.1.6.3利用C3植物的光合数学模型(参考 Medlyn 等.2002a.2002b和 Bernacchi 等.2003)，对不同温度下的转基因番茄碳流量控制系数进行估算(参照Volker ，2002）并对单个sikFBAase碳流量的控制系数。
3.1.7 天山雪莲sikFBAs基因协同作用分析和杂交番茄的低温生长性能评价 3.1.7.1在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下，对表达不同sikFBAs基因的转基因番茄在不同发育时期的株高，叶数、叶
长、叶宽、鲜重及干重比、根茎比、生长速率等进行测定，分析sikFBAs对番茄生长特性的影响。
3.1.7.2 在20℃、15℃、10℃、5℃温度及1000，500，250μmol·m-2·s-1光照条件下，测定转基因番茄的相对电导率、丙二醛和脯氨酸(参照下面生理指标测定）、，测定绿素荧光参数、光合响应参数和气体交换参数（参照下光合参数测定方法），关联分析光吸收、光合电子传递、碳同化间能量分配(参照康华靖，等 2011），分析逆境下碳同化能提高与抗寒性的关系。
3.1.7.3 将获得具有抗寒作用转基因番茄，筛选抗寒性转基因株系进行两两互交，对T1代进行协同作用分析，并在冷凉的自然低温条件下进行低温光合的田间适应性分析。
3.1.8 叶片光合相光参数测定（气体交换-P700-叶绿素荧光同步测量系统（德国）带有Dual-PAM气体交换叶室——3010-DUAL）
3.1.8.1 光响应曲线的测定（Pn-PAR）
按照设定的2 000,1 800,1 600,1 400,1 000, 800, 600, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 0 μmol·m-2·s-1光照梯度序列，测定新疆雪莲叶片净光合速率的大小，自动完成（Pn-PAR）光响应曲线。测定设置3次重复，依据方程(4)计算最大净光合速率(Pmax)，并确定其光补偿点(LCP)和光饱和点(LSP)(Bassmanet al.,1991)：Pn=Pmax(1- C0e?PPFD/Pmax ), (4)式中：?为弱光下光化学量子效率， C0为度量弱光下净光合速率趋于0的指标，通过适合性检验,拟和效果良好。测定时的空气温度，空气中CO2，相对湿度,根据测定气孔导度(Gs,mol·m-2·s-1) ，叶温下蒸汽压亏缺(Vpdl)等光合生理特性指标。根据参数计算气孔限制值Ls和水分利用效率WUE，叶片的光能利用率(PE)(Berryet al.,1982)，其公式分别为:Ls= 1-(Ci/Ca)、WUE=Pn /Tr。表观量子效率AQY＝dPn/dPFD。200,100,50,20,10,0Lμmol·m-2·s-1光照梯度下的净光合速率值,进行回归所得曲线的初始斜率为表观光量子效率(AQY)。与净光合速率所在的轴相交的截距为暗呼吸速率(Rd)。 3.1.8.2 CO2响应曲线（A-Ci）
将由光曲线所确定的光饱和点作为最适光照强度,利用CO2注入系统,按照设定的400, 300, 200, 100, 50, 0, 400, 400, 600, 800, 1 000, 1 200, 1 400, 1 800, 2 000 μL.L?1的CO2浓度梯度序列,测定天山雪莲叶片净光合速率的大小，自动完成A-Ci
曲线。确定CO2补偿点(CCP)和CO2饱和点(CSP)。在CO2浓度低于200Lmol·mol-1以下时测定的净光合速率值,进行回归后所得直线方程的斜率为羧化效率(CE)。与净光合速率所在的轴相交的截距为光呼吸速率(Rp)。 3.1.8.3 叶绿素荧光参数
同步测定叶素素荧光参数。 PS II参数：Fo, Fm, F, Fm’, Fv/Fm, Y(II)=△F/Fm’, Fo’, qP, qL, qN, NPQ, Y(NPQ), Y(NO)和ETR(II)等。PS I参数：P700, Pm, Pm’, P700red, Y(I), Y(ND), Y(NA)和ETR(I)等各参数意义及计算公式如下：光化学猝灭系数qP =(Fm’- Fs)/( Fm’-F0’) (van Kooten 和Snel 1990)；PS Ⅱ反应中心光能捕获效率Fv’/Fm’ =( Fm’- F0’) / Fm’(Demmig-Adams 和Adams 1996)； 实际光化学效率ΦPS Ⅱ = qP×(Fv’/Fm’) =(Fm’-Fs)/ Fm’(Genty 等1989)。有效荧光产量（△ Fv’/Fm’）=（Fm’-Ft）/ Fm；非光化学荧光淬灭系数（NPQ）=（Fm-Fm’）/ Fm’；电子传递速率(ETR)ETR=Fm’-Fs/Fm’×光合光子通量密度PPFD ×0.5×a,a为叶片光吸系数( Miyake C，et al.,2000)。各符号的意义如下：Fo’为光适应后的初始荧光；Fm’为光适应后的最大荧光；Fv’为光适应后的最大可变荧光；Fs 为光适应后稳态荧光。
3.1.8.4气体交换参数（Gas-Exchange Measurements）
参比室和样品室的CO2绝对值（CO2abs，CO2sam），参比室和样品室的H2O绝对值（H2Oabs，H2Osam），流速（gas flow），环境气压（Pamb），叶室温度（Tcuv），叶片温度（Tleaf），环境温度（Tamb），环境PAR（PARamb），叶室内叶片正面PAR（PARtop），叶室内叶片背面PAR（PARbot），叶室相对湿度（rH），蒸腾速率（E），水气压饱和亏（VPD），叶片气孔导度（GH2O），净光合速率（A），胞间CO2浓度（Ci），环境CO2浓度（Ca），植物水分利用效率，CO2响应曲线，光响应曲线等。
光合速率的温度响应曲线（A-Ta）与温度相关的暗呼吸速率（ Rd） 和光合速率（ A ）在光密度 1,500 μmol m?2 s?1 条件下，在20℃ 、15℃、10℃到5℃范围内，对的新的雪莲完全展开叶，参照(Yamori et al., 2005). 蒸气压亏缺小于 1.0 kPa 在10℃ 到30℃ ，光合速率和呼吸速率的温度响应曲线。在各温度点测定CO2响应曲线（50, 100, 150, 200, 360, and 1,500μL L?1 ）。利用统计软件（SPSS）对立方曲线光合参数进行数据拟合，计算光合最适温度（optimum temperature）。 3.1.8.5环境因子的相关性分析
气体交换指标与环境因子的相关性分析，天山雪莲净光合速率与叶温和大气温度的关系,定量分析温度对Pn的影响。同时，分别以Pn,Tr,Gs为因变量，用SPSS 13分析其与环境因子PAR,Ta,Tl, Ca和空气相对湿度(RH,%)等为自变量的各因子间的相关性；以及与Pn相关的各气体交换指标间的相关性。 3.1.9 抗性相关生理指标
3.1.9.1 相对电导率、丙二醛和脯氨酸的测定
按照赵世杰（1998）的方法，使用电导仪测定叶片电导率。其中相对电导率（%）=（初电导-空白）×100/（终电导-空白）；伤害度=（处理相对电导率-空白相对电导率）/（100-空白相对电导率）。参考赵世杰等（1994）的方法进行丙二醛（MDA）含量的测定。酸性茚三酮比色法测定脯氨酸含量(Bates等,1973)。
3.1.9.2 可溶性糖和叶片淀粉的测定（蒽酮比色法）
约100 mg鲜重的叶片提取用1 ml 80%乙醇在80 ℃浸提30 min，然后用1 ml 50%乙醇在 90 ℃ 浸提 30min，再用 1 ml H2O 在 95℃ 浸提30 min，合并后的上清用于葡萄糖，果糖和蔗糖H测定，方法参照（Stitt et al. (1989)。
叶片淀粉的测定方法参照(Smith and Zeeman, 2006)。
用酒精提取可溶性糖，反复提取直至提取液中无明显可检出可溶性糖，取提取后的残渣0.5g，放入三角烧瓶中，加2%HCl 25mL，盖上，在沸水浴锅中沸腾3.5h，用碱中和至中性过滤,测定其葡萄糖含量。 3.1.10 中间代谢物定量分析（Uematsu.2012）
3.1.10.1 叶片光照12 h后取样，处理后，立即被放入液氮速冻，–80℃储存，直到使用。光合碳同化的中间产物的定量制备方法采用 (Hasunuma et al.,2010) 和分析采用LC-MS/MS。所有分析都使用4000 QTRAP LC-MS/MS system (AB SCIEX, Tokyo, Japan) 设备，带高性能的 HPLC系统 (Shimadzu, Kyoto, Japan) 和涡轮增压的离子源 (AB SCIEX)。分离采用反向离子对液相色谱，其液相色谱柱(5 lm, 150 mm34.6 mm, Shimadzu)。数据的获得和分析使用机带软件。 3.1.10.2 ATP含量的测定：采用生物发光法测定ATP含量。用丙酮浸提样本，以荧光素酶-2荧光素为发光试剂，用FG2300 发光光度计测定ATP含量（樊广华等，2005）