U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。
U3/6ProNickTarget adaptergRNAregionI Two BsaI-cut ends are linked to an adapter II III IV V Two BsaI-cut ends are linked to different adapter Two adapter ends of product s II & III are polished to blunt and linked to produce IVTwo BsaI-cut ends are polished to blunt and linked together Forward adapter Reaction 2primer/gRNAdownstream primerFirst PCR (2reactions):U3(6)upstream primer U-F/Reverse adapter primerReaction 1U-FIIIIV The product IV with doubled target sequence are amplified into two desirable fragments II & III, and the product V is not amplified. III gRNA-RTake 0.1 ?l Nested PCR:AnnealingExtensionSite-specific primer (Bn’)BsaIPCRBsaIBsaISite-specific primer(Bn+1)BsaI
在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离， U3/6和gRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。
4.3 gRNA表达盒扩增引物
第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：
U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3; gRNA-R: 5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3
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第二轮PCR扩增引物（使用策略I Golden Gate ligation的位置特异gRNA表达盒专用）：
（B1’, B2, B2’, B3, B3’等表示各连接点位置； ctcg, tcag等表示Bsa I 切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端）
靶点1（T1）： SpeI
（new）Uctcg-B1’: TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U3/6上游引物） gRctga-B2: AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3（第二轮gRNA下游引物） T2:
Uctga-B2’: TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaaga-B3: AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T3:
Uaaga-B3’: TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T4:
Ugact-B4’: TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRggac-B5: AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T5:
Uggac-B5’: TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRtctg-B6: AGCGTGggtctcGcagaGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T6:
Utctg-B6’: TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaggt-B7: AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T7:
Uaggt-B7’: TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRcgct-B8: AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 T8:
Ucgct-B8’: TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
(如果要多于8个靶点，通过设计不同的BsaI切点碱基，合成新引物对）
最后靶点(Last site) MluI
（new）gRcggt-BL:AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3 （与载体RB侧B-R互补）
当靶点数少于8个时，gRcggt-BL（BL）作为最后一个gRNA表达盒下游引物替代B2,B3, B4...，见
以下引物使用方法)
4.4 靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法
本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子（OsU3, OsU6a~c）。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为： 1个靶点：LacZ-U3 2个靶点：LacZ-U3—U6a 3个靶点：LacZ-U3—U6a—U6b
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4个靶点：LacZ-U3—U6a—U6c—U6b 5个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6c—U6b 6个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6c—U6b 7个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6c—U6b 8个靶点：LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c
靶点接头设计：由于靶点接头的正向引物的5’端4个碱基是根据使用的不同启动子而不同的，因此要确定那个靶点使用那个启动子的基础上合成其正向引物。
特定位置gRNA表达盒引物使用方法 (U#=U3, U6a~c)： 1个靶点：用引物对B1’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA;
2个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;
3个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA; 4个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/B4, B4’/BL 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA 5个或以上靶点： 如此类推。
4.5 靶标gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B) 的连接方法
本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装： 策略I
用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)； 策略II用Gibson assembly方法(Gibson,
et al., 2009, 2010)。Golden Gate ligation是利用Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不
重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如下图, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU3上游附有LacZ标记基因(198 bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆，达到绝对真阳性。策略II见后面介绍。
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靶点设计，接头引物合成gRNA质粒先切后连gRNA质粒BsaI酶切gRNA表达盒连接物连接第一轮PCR(每种2反应)扩增产物(混合)Golden Gate引物第二轮PCRGibson Assembly引物gRNA表达盒gRNA表达盒BsaI 切pYLCRISPR/Cas9质粒Golden Gate 连接（边切边连）Gibson Assembly连接转化阳性菌落(蓝色），PCR确认，MluI酶切，测序
操作流程图
SpeIMluI(B1’)LacZctcgU3 pr(B2’)T1ctgagRNAgact(B2)(B3’)T2aagaU6b prgRNAU6a prttct(B3)(B4’)gactgRNActga(B4)T3T4U6c prMluIgRNA(B-R )cggtgcca(BL)gagc(B-L ) E.coliPrGolden Gate ligationB-LB-RAscIPubiP35:HPT (Bar)
RBpCas9TnosAscIpYLCRISPR/Cas9-MH (B) constructpVS1repliconLBKanrpBR322 oripBR322 born 注：由Uctcg-B1’导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”，其用途是，在构建好一组目的靶点gRNA
表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒，可以用Spe I将载体切成线状，再用策略II（Gibson Assembly，见后面）将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。
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5 多靶点载体构建详细操作方法（策略I）：
（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9-MH (B)菌种(TOP10F’)和CRISPR/gRNA vectors 菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素（25μg/ml）和氨苄青霉素（50μg/ml）平板培养基划出活化单菌落，取单菌落培养1ml种子液（不要将保存的菌种直接接种子液！），再扩大培养用于提取质粒。
pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 载体较大（约16.5 kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5?g/?l）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/?l冷冻保存，作为步骤（10）使用。
由于BsaI是很容易失活的酶（有时新买的BsaI是失活的！），在进行以下步骤之前，先检测BsaI活性： 配制10 μl BsaI反应液，含有5U BsaI, ~100 ng pYLgRNA-U# (或其它有AmpR基因的质粒)。37℃15min后电泳检查（也电泳50ng未切的相同质粒为对照）。pYLgRNA-U#的BsaI图谱见第2页。最好把BsaI分装成几管冷冻保存。
(2) （推荐使用以下4+5步骤边切边连方法，这个步骤只做参考，如果采用边切边连方法，不需要执行这个步骤）取约2-3 ug pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在50 μl（30U BsaI）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）（不要用太多酶或太长时间过度酶切）。 用0.5x TE洗回收胶30分钟，65 ℃ 3 min熔解，在40 ℃加入Agarase（1U/100μl胶， NEB)处理30分钟后，分装成每管40-60ng（2-3 μl）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。
（3）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100 μM母液，各取1μl加入到98μl 0.5x TE混合稀释到1 μM。约90℃ 30 S，移至室温冷却完成退火。
（4）gRNA载体酶切：取pYLgRNA-OsU3/LacZ 等质粒各约1 ug，在25μl反应用~10 U BsaI （NEB公司）酶切20 min（不要用太多酶或太长时间过度酶切），70℃ 5min失活酶。冷冻保存公用。 （5）gRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应： 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer； 0.5 μl (~20 ng) pYLgRNA-OsU#质粒； 0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM) 加 ddH2O至 10μl
最后加约20~35 U (0.05~0.1 μl) T4 DNA ligase (Takara，其它公司的T4 DNA ligase单位定义不
同，但每μl的酶活相当)
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