注：由Up-T1导入的载体唯一Spe I位点是特别留的一个“后门”。其用途是，当构建好第一组目的靶点gRNA
表达盒的载体后，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒时（或靶点数目较多，一次连接所有gRNA表达盒不能成功，可以把它们分成2组连接）。可以用Spe I将载体切成线状，再继续用Gibson assembly将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。第二组靶点gRNA表达盒的扩增需要用gR-R2替代gR-R（Up-T1不变）。也可以利用此位点（或策略I构建载体留的Spe I位点）插入其它目标基因片段。 Mlu I gR-R2: TGTCAACGCGTCCTTTGCTGCCGATTCCAGGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (第一组T1-gRNA
表达盒使用了LacZ-OsU3启动子)。如果第一组的T1-gRNA表达盒不是用LacZ-OsU3启动子，gR-R2的 5’端的TGTCAACGCG要替换成如下碱基： OsU3: AAAGATTCCT; OsU6a: CAGGAAAAAA; OsU6b:TGCAAGAACG; OsU6c:CGCTAATGAG（这是各不同启动子的5’端10 bp，作为连接位点的一部分，见附录序列）。其它Up-T#/gR-T# 的使用原理与第一组的相同，但不能重复使用第一组用过的Up-T#/gR-T# （Up-T1可以再使用）。如果是有计划分2组克隆，建议将LacZ-OsU3启动子留在第2组使用，因为第2组克隆的难度大些，可利用LacZ帮助筛选阳性克隆。
如果第一组靶点gRNA表达盒是用策略I构建的，第二组靶点gRNA表达盒的克隆就使用Spe I切开载
体，使用Up-T1b (ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGGAATCGGCAGCAAAGG-3)替换Up-T1。
gR-R2的序列（及其10碱基替换，如果需要）与以上相同。
（2）自制Isothermal in vitro recombination reaction mixture：
5X isothermal（ISO）reaction buffer：25% PEG-8000，500 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，50 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，4种dNTPs 各1 mmol/L，5 mmol/L NAD，?20 °C保存。
2X master mixture：160 μL 5 × ISO buffer, T5 Exonuclease (Epicentre) 1.5 units（严格控制T5 exouclease酶量，不能过多！过多T5 exouclease会造成DNA片段被快速降解），Phusion High-Fidelity DNA polymerase (NEB) 20 units, Taq ligase (NEB) 2000 units, deionized water to 0.4 mL。多管分装?20 °C保存
（3）参考第7页指引设计U3/6启动子排列。但如果是4个靶点，建议把较长的U6c用于T3, U6b用于T4,
这样可以用SP2测通T4和T3（见以下步骤7）。
（4）在50 μl反应用20 U Bsa I酶切~2 μg pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 约30 min。取2μl（~80 ng）电泳检
查，确认被切出的ccdB条带（732bp）。65℃5min失活，每管3μl（100~120 ng）约分装冷冻保存。（一般不需要回收纯化，也可使用策略I步骤2电泳回收纯化的样品）。
（5） 按以上策略I步骤2至步骤6的第一轮PCR同样操作；第二轮PCR使用以上引物对(各引物0.15μM)
扩增各靶点（T1, T2, T3,...）的gRNA表达盒片段。取2 μl电泳检查。
（6）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化；或在PCR产物中加入5 U 单链核酸酶Exonuclease I (Takara)在37°C处理10-15 min消除剩余引物（这是为
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了避免引物与目的片段竞争结合），80°C 20min失活ExoI（以避免消化Gibson反应中产生的单链末端），不需纯化直接取适量进入步骤7。
（7）参考策略I步骤9，在分装有pYLCRISPR/Cas9-MH (B)（100~120 ng）的管中加入适量的gRNA表达盒片段，加入去离子水至最终量7~8 μl。加入等量7~8 μl 2X master mixture，50 °C反应25 ~30 min（时间过长可能会造成DNA被T5 exouclease降解！）。可以取10 μl连接产物电泳检查，正常反应可见连接的较大片
段（见18页图）。
（8）参考策略I步骤11-13操作，但在透析膜对1/5 x TE透析较短时间的5-10 min（这是因为ISO buffer含有PEG-8000，过长时间透析会吸收过多的1/5x TE降低连接产物浓度。但不透析直接电激转化容易打炸或电激电流过大而降低转化效率）。 测序策略既可以按策略I步骤13进行，也可以用以上的通用引物Sp6 promoter primer等（测序公司可提供，将这些测序引物序列交测序公司确认）从gRNA往启动子方向进行测序，每个引物可以测通2个靶点。
Construction of a CRISPR/Cas9 vector with four targeting sites0.5 kb23 kb9 kb1 kb0.5 kb15 kb3,Colony PCR screening for positive clonesCas9vector backboneLinked 4 gRNAexpression cassettes1,Recovered Cas9vector backbone digested with BsaI2, PCR amplification of four gRNAexpression cassettes 3 kbChecked clones4,Restriction analysis of positive clones with AscICas9 vector backboneLinked 4 gRNAexpression cassettes5,Stability verification of the Cas9construct in Agrobacteriumtumefaciens(the plasmid from Agrobacteriumwas transferred back to E. coli, then clone plasmids were isolated and digested with AscI)
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Construction of a CRISPR/Cas9 vector with eight targeting sites2 kb0.5 kb1, PCR amplification of eight gRNAexpression cassettes (first round of amplification)23 kb4.3 kbCas9vector backboneLinked 8 gRNAexpression cassettes2,Restriction analysis of positive clones with AscI1 kb0.5 kb3, Testing one positive clone with PCR, using pairs of the target adaptor primers(F, R are forward and reverse primers, respectively).Cas9vector backboneLinked 8 gRNAexpression cassettes4,Stability verification of the Cas9construct in Agrobacteriumtumefaciens, clones were digested with AscI
PCR-amplified sgRNA expression cassettes 2 kb0.5 kbGibsonassembly productsVector;Vector + gRNAcassettes5kbLinked gRNAcassettes1kb23 kb4 kb2 kbLinked 6 sgRNA expression cassettes
A 6-target CRISPR/Cas9 construct prepared by Gibson assembly
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T1T2AAACCATCTG--GTTGTAAGCAAGCC5’-AAACCATCTGCAGTTGTAAGCAAGCC(WT)GTCGGCCGGCAGCTGAACTGACGGAC5’-GTCGGCCGGCAGCCGGATGACGGGCA(WT)T3T5GTCACGAGGTAGGGAT-CTTTGGCATGTCACGAGGTAGGGATCCTTTGGCAT(WT)AGATATTGGTGGCACCGACCTTGAGGGTAGATATTGGTGGCACCGACC-TGAGGGT(WT)T6T7CCGCCGTCG-CGGCAAGCCGCGCGTCCCGCCGTCGCCGGCAAGCCGCGCGTC(WT)CGACGGTGCTGATGAAGGATTCCAGGACACGACGGTGCTGATGAAGGAT-CCAGGACA(WT)T8Edited sites in a transgenic rice plant with an 8-target CRISPR/Cas9 construct TCAATCTTCACTAGCCATGTACAAGGGACCTCAATCTTCACTAGCCATGT-CAAGGGACC(WT)
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附录序列信息(每个PCR扩增序列为活字)：
pYLCRISPR/Cas9-MH (B)克隆位点附近关键序列
GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdB)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGG
LacZ-OsU3-gRNA载体部分序列gRNA下游引物U3/U6上游引物第二轮gRNA-RU-F第二轮BsaIBamHIgRNAacccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGAMluIE.coliPromoter LacZ(alpha)CATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaa tcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgc OsU3 PrgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCAT GGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGG GAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAAGAGACCTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact..(pUC18骨架）BsaIHindIII
PCR扩增的LacZ-OsU3-gRNA单元序列（767 bp, Bsa I酶切后737 bp）：
TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA(19-20pb靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGG CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCT
OsU3-gRNA载体部分序列gRNABsaIBamHIacccggGGATCCTAGCCGGGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGGCAGCAAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAAGAGACCTCTGAAGATAACATACTAAGCTTggcact(pUC18骨架）BsaIHindIIIgRNA下游引物第二轮gRNA-RU3/U6上游引物U-F第二轮
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