室温（20-28 ℃）连接约10-15 min（过多DNA ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV &V !）
（4+5）步骤4、5结合的简化（边切边连法）方法：配制10 μl 1x BsaI酶切连接反应液：在1x Bsa I-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM，加入约20 ng pYLgRNA-OsU#质粒（预先配好20 ng/μl保存），0.5 μl接头（最终浓度0.05 μM），~5 U BsaI，~35 U T4 DNA ligase（此buffer对Bsa I和ligase都有效）。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.2~0.3 μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer（10x NEB T4 DNA ligase buffer中含有10 mM ATP, 但10x Takara T4 DNA ligase buffer中含有1.0 mM ATP，因此优先用NEB的；或加1μl 10 x Takara T4DNA ligase buffer）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4 DNA ligase buffer缺少KCl或NaCl，不适合Bsa I酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37℃ 5 min，20℃ 5 min。
(6) 扩增gRNA表达盒（虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见第6页） （a）第一轮扩增（每个gRNA表达盒2个PCR反应，各15 μl）：
取1 μl连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向引物/gRNA-R（反
应2），各0.2 μM, 适量高保真PCR酶，最好使用KOD-Plus (TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KOD FX，或Takara ExTaq。不要使用能在产物3’附加A碱基的Taq酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。
25-28 循环：95 ℃ 10s，60 ℃ 15s ，68 ℃ 20 s
(任意) 取 4 μl电泳检查（反应2产物长度约140bp，最好用PAGE检查，或用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。 （b）第二轮PCR：
按第6-7页所示，预先将位置特异引物对混合成10 x工作液，每种1.5 μM： B1’ + B2 (PT1); B2’ + B3 (PT2); B3’ + B4 (PT3)； B4’ + B5 (PT4)； B5’ + B6 (PT5)；B6’ + B7 (PT6)；B7’ + B8 (PT7)； B1’ + BL (PT1L); B2’ + BL (PT2L); B3’ + BL (PT3L); B4’ + BL (PT4L); B5’ + BL (PT5L); B6’ + BL (PT6L); B7’ + BL (PT7L); B8’ + BL (PT8L)。 引物组合
1个靶点：PT1L；
2个靶点：PT1，PT2L； 3个靶点：PT1，PT2，PT3L;
4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4L;
5个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5L;
6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6L；
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7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7L； 8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，T8L
取第一轮PCR反应1，2产物1μl用H2O稀释10倍，各取1 μl混合为模板。各表达盒20-50 μl PCR (1个靶点50μl； 2-3个靶点各30μl；4个或以上靶点各20μl)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15μM）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。扩增15-20 循环(实际情况调整)：95 ℃ 10s，58 ℃ 15s，68 ℃ 20 s。取 2 -3μl电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。注：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为Bsa I切后）：U3-gRNA=767 bp(728 bp); U6a-gRNA=629 bp(599 bp); U6b-gRNA=515 bp(485 bp); U6c-gRNA=924 bp(984 bp)。
（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化(除去Taq酶以防止下步骤补平BsaI酶切末端)。
（8）（如果采用步骤10方法II，不需要此步骤8和9）混合产物在50μl BsaI反应，用20 U BsaI 37 ℃酶切30 min，73 ℃ 2 min（使切出的13 bp末端小片段变性，以减少连接竞争）。用PCR产物纯化kit纯化，以去除切出的13/17碱基末端片段以防止连接竞争。
（9）方法I：在切好分装（步骤2）的pYLCRISPR/Cas9-MH (B) (约60-80ng）管中，加入相当于每个靶点约10-15 ng的步骤（8）酶切PCR产物(如1个靶点约10ng、 2个靶点共20-30ng、 3个共约40-50 ng、 4个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15ng/片段）,不要加入过多的gRNA表达盒片段。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6) ，在10 μl 连接反应（加35 U连接酶，不要过多连接酶）， 16 ℃（或最好用变温循环: 10 ℃ 5min，20℃ 5 min；10-15循环）连接2-3h（不要过长时间连接）。做3个以上靶点Cas9载体构建时，最好把Bsa I切好的多个gRNA表达盒混合片段（先不加pYLCRISPR/Cas9-MH (B)片段）先在20℃连接约~3 min将其连接成一个片段，再加入pYLCRISPR/Cas9-MH(B)片段(约60-80ng），再连接2-3个小时。
（10）方法II（边切边连法）：作为步骤8，9的简化替代操作，从步骤（7）取约20-70 ng 产物（参考步骤9中gRNA表达盒片段使用量），加入约60-80 ng 未切割的pYLCRISPR/Cas9-MH (B)质粒（预先稀释成约100 ng/?l冷冻保存），在15 μl反应（1x Bsa I-内切酶Buffer）用10 U BsaI 37 ℃酶切~10min（不要过多BsaI和过长时间，否则载体会产生破坏平滑末端而自连）。（不要失活Bsa I !）加入ATP至终浓度0.5~1.0 mM。如果实验室没有ATP，加~0.5 μl 10 x NEB T4DNA ligase buffer (或1.5μl 10 x Takara T4 DNA ligase buffer)，和35 U ligase（不要过多连接酶）。 用变温循环酶切连接约10-15循环: 37℃ 2 min；10 ℃ 3 min，20℃ 5 min；最后37℃ 2 min。此方法要点：由于没有去除Bsa I切出的13/17碱基小片段和ccdBs片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被Bsa I切除，而连接好的目标产物序列由于不存在Bsa I的识别位点不会被切断。此方法简便效率高，阳
性克隆率高，推荐优先使用。
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（11） 电激法转化：将连接产物滴载在悬浮式透析膜Millipore VSWP04700（0.025μm孔径）对1/5 x TE透析15~30 min（最好在4℃冷柜内）脱盐（或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5 μl 去离子水），取1-1.5μl连接产物电激转化E. coli DH10B 感受态细胞（虽然其它菌株也可以用，但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养（不要用LB培养），以10 pg pUC18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯），要求达到效率>109 colonies/1μg pUC18(即电激10 pg质粒，涂1/20 转化细胞出500以上菌斑)。 >15kb大质粒的电激电压为1500-1600 V/20μl感受态细胞/1μl电激杯（或2500V/40μl感受态细胞/2μl电激杯）；电激后加入1ml SOC (不要用LB)）,37℃培养1-1.5h。涂板培养基为LB+ 25μg/ml Kan, 0.3~0.5 mM IPTG (使用Lac Iq基因型菌种用1.0 mM)，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表达盒）的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑。注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdBs功能突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdB的空载克隆。
化学熱激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。 （12）阳性克隆确认：用常规碱裂解法提取质粒，取约100ng（20μl反应）用MluI（由LacZ-OsU3表达盒和BL引物导入Mlu I位点）切出串联的gRNA表达盒片段（以未切的空载环状质粒为对照）电泳检查其大小是否符合预期（各gRNA表达盒片段大小之和）。如果Mlu I切不动（电泳显示没有插入子片段且带型与未切空载环状质粒相似，即条带较宽拖尾），这是空载体。
（如果做以下步骤测序，可不做这个PCR检测）取少量（1~3 ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：SP-DL引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；?如此类推，最后靶点正向接头引物与SP-R引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。
（13）测序检测：（如果通过步骤12 PCR检测阳性，可不做测序）利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序. 注意：由于U6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通U6c到靶序列（T#），如果U6c是最后一个表达盒，要用SP-R (见第2页)进行测序；如果U6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施）。
SP-ML 测T1以T1正向引物测T2以T2正向引物测T3U6cT#SP-R测T#RBSP-RT1T2T3
（14）在农杆菌的稳定性检测(任意步骤)：获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105），从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5 ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物
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配对进行PCR确认。或将质粒转化DH10B，再提取质粒酶切分析。
(15) 打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心，在两侧各离开约150 bp处合成引物。可将T0或T1植株的靶点PCR产物不经克隆直接测序。从测序出现杂波峰或突变型波峰判断突变状态。
策略II: 基于Gibson Assembly的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法
Gibson 等开发了一种“isothermal in vitro recombination reaction”，也称为 “Gibson Assembly” 可进行多个PCR片段的连接(Gibson, et al., 2009; Gibson, et al., 2010; Gibson, 2011)。商业的连接克隆试剂盒“Gibson Assembly Kit” (NEB)就是基于此技术, Takara的In-Fusion 使用不同酶系，原理相似，也可以达到相同目的，但这些试剂盒很昂贵！（1500-1700元/10次反应）。本实验室利用自制的isothermal in vitro recombination reaction mixture (见以下，成本非常低)，可进行质粒载体的多个片段同时克隆和缺失（Jiang et al., 2013. One-step cloning of intron-containing hairpin RNA constructs for RNA interference via isothermal in vitro recombination system. Planta 238, 325-330; Zhu et al., 2014. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene 548, 39–42）。以下介绍基于Gibson Assembly的CRISPR/Cas9多靶点载体的构建。 (1)
根据在一个载体构建靶点数的需要，合成以下引物对（gR-L是最后一个gRNA表达盒用）。 以下相同颜色表示连接配对序列，右端斜体表示与U3/6启动子上游配对序列，方框为各种通用引物配对位点，测序检验阳性克隆时测序公司可以提供这些通用引物。
Spe I Up-T1: ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线与GAS-L配对)
gR-T1: CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Ptac promoter F primer site)
Up-T2: GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gR-T2: CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (Sp6 promoter primer site)
Up-T3: CGCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGCGTGGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gR-T3: GTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCAAGCTCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 terminator F primer site)
Up-T4: GAGCTTGGCCGCTGAGCAATAACTAGCGACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gR-T4: CATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCATTGAACATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (EGFP-N primer
site)
Up-T5: GTTCAATGGTCGAGCTGGACGGCGACGATGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
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gR-T5: GCTCCGAATACGACTCACTATAGGGTGACCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T7 universal
primer site)
Up-T6: GGTCACCCTATAGTGAGTCGTATTCGGAGCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gR-T6: CTGAGGTTAACCCTCACTAAAGGGAAGCTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (T3 Promoter
primer site )
Up-T7: GGAGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAACCTCAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gR-T7: CGTGGTATGCTAGTTATTGCTCAGCCTCGACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7 terminator R primer site)
Up-T8: GTCGAGGCTGAGCAATAACTAGCATACCACGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
（gR-R为右侧最后一个表达盒反向引物。如1个靶点，Up-T1与gR-R配组；2个靶点，Up-T2与gR-R配组；3个靶点，Up-T3与gR-R配组，...如此类推）
gR-R: TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3 (下划线
与GAS-R配对) Mlu I （以上引物对单双子叶植物用Cas9载体通用）
为方便操作，参考11页模式预先混合好引物组。
MluIGAS-LLacZT1Ptacpromoter F primerU3 U#T2Sp6 promoter primerSpeIT3Sp6 universal primerU#U#T4MluIGibson AssemblyNotIPubipCas9TnosRBGAS-LGAS-RGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGGibson assembly site (GAS-L)AAG(ccdB,657bp)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGC Gibson assembly site (GAS-R)ATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR/Sequencing primer (SP-R):15
P35:HPT(Bar)pYLCRISPR/Cas9-MH (B)LBKanrpVS1repliconpBR322 oripBR322 bornNotIPCR/Sequencing primer (SP-ML)AscI B-L BsaI BsaI B-R AscI NotI