湖北理工学院 毕业设计（论文）
（GBICO，USA），胎牛血清(碧云天)，单人单面净化工作台（苏州净化，中国），饱和湿度二氧化碳培养箱（Thermal Scientific,USA），倒置显微镜。 3.4.2 细胞培养
复苏：1.取出液氮中的冻存管，于37℃水浴锅中迅速放入，轻轻晃动。待融化所有的液体后（大概一分半钟），对超净工作台进行消毒处理。2.离心管中装入10ml培养基的15ml的离心管，把培养的细胞悬液吸到离心管中，的（用培养基将粘壁细胞洗掉），1000转离心5分钟。3.去除上清液，将培养皿中加入培养基，促使细胞悬浮。把装有10ml培养基的10cm培养皿里加入细胞悬液，前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4.放到CO2培养箱中培养，并在之前标好细胞类型和日期、培养人等，及时更换培养基防止细胞贴壁。3天将培养基换一次。
传代：1.当覆盖率达到80%-90%时,细胞要传代。2. 吸掉培养皿中的培养基。3.加适当的胰蛋白酶消化分散细胞120s。4.终止消化时确保细胞都变圆后，往其中加入含血清的培养基。5.悬浮细胞的方法:用Marker枪对细胞反复吹打。6.向离心管中加入15ml细胞，离心1000r，5min。7.将上清液倒掉，并加入培养基1-2ml，用移液枪吹打细胞。8.一般,癌细胞分5个培养基,正常细胞传3个培养基。然后继续培养。
冻存：将消化下来的细胞离心。配制好冻存液，然后把悬浮细胞，取灭菌的冻存管进行分装，放置一段时间，细胞种类，冻存日期等记录好。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃，第二天保存到液氮灌中。冻存液的配制：70%的完全培养基加入20?S和10%DMSO。DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。 3.4.3 地木耳多糖抑制Hela细胞侵袭活性检测
划痕实验：(1)用胰蛋白酶消化Hela细胞,并吹打成浓度为大约5×104个/ml的细胞悬液;(2)用marker笔在12孔板的后面用直尺均匀的画横线,每孔画1条线; (3)在12孔板中分别加入实验组和对照组细胞;(4)放入,5% C02，37℃细胞培养箱中继续培养;(5)第2天用10ul的无菌枪头划横线,枪头尽量垂直,不要划歪，不要倾斜;(6)用配制好无菌PBS洗涤数次,去除划痕下的残留细胞;(7)加入含不同浓度NCV多糖或对照培养液;(8)再放入37℃,5à2细胞培养箱中继续培养,分别在0,6，12，24，48h后观察照相。
利用画图工具网状格功能统计各组划痕在各个时间段相对宽度，通过迁移百分比确定地木耳多糖对抑制HeLa细胞迁移的能力。
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3.5 实验结果
3.5.1地木耳多糖含量测定
1.标准曲线的绘制，配制不同浓度的标准葡萄糖溶液测得的OD值（表一），根据OD值绘制出一条葡萄糖标准曲线，其方程式为y=0.0094x+0.1744(表二)。 （表一）葡萄糖溶液浓度、OD值对照表
糖浓度mg/ml OD值 0 0.175 10 0.262 20 0.358 30 0.473 40 0.546 60 0.735 80 0.925
（表二）葡萄糖标准曲线
2. 地木耳多糖含量测定
将不同浓度地木耳多糖的吸光度值（表三）带入葡萄糖标准曲线当中，测得利用水提法提取地木耳多糖的提取率为7.86%。
（表三）地木耳多糖不同浓度的OD值 多糖浓度mg/ml OD值 0.000 0.246 0.100 0.300 0.300 0.396 0.600 0.518
3.5.2 抑制Hela细胞侵袭活性检测
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利用photoshop中的测量软件，测量不同加药剂量下0，6，12，24，48h时的划痕宽度。以对照组与40ug/ml组为例，随着培养时间的增加，划痕的宽度明显减小（图一与图二），说明本次实验中的HeLa细胞具有明显的迁移能力。
图一 空白组在不同时间下的划痕宽度
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（图二）40μg/ml地木耳多糖在不同时间下的划痕宽度
通过划痕宽度百分比来分析地木耳多糖对抗Hela癌细胞侵袭能力的实验发现，在一定的浓度范围内，地木耳多糖抗侵袭作用具有浓度依赖性。对比空白组的划痕宽度（图一）和40μg/ml地木耳多糖组的划痕宽度（图二）减小的速度，可见40μg/ml组恢复速度明显减慢。统计各浓度不同时间相对于0小时的划痕宽度
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百分比的均值（表四），可见40ug/ml组下划痕宽度明显恢复较慢。对48小时下各浓度组与空白组划痕宽度的差异做显著性分析，发现相对于对照组，20ug/ml组与40ug/ml组的差异显著，P值均小于0.01（表五），而10ug/ml组差异不显著，可能是剂量不足引起的。
（表四）：各时间相对于划痕宽度百分比统计表
6h
12h
24h
48h
空白组相对D百分比 92.1% 86.3% 87.1% 87.4% 95.2%
72.5% 78.3% 81.8% 88.9%
53.6% 66.8% 71.1% 82.2%
10μg/ml相对 D百分比 93.1% 20μg/ml 相对D百分比 95.5% 40μg/ml相对 D百分比 98.2%
（表五）P值对照表
(I)x (J)x Sig. LSD 0 10 .086
20 .002 40 .000