离体无性繁殖程序： （1）无菌培养物建立 （2）培养物的增殖 （3）生根培养 （4）炼苗和移栽 （5）再生植株的鉴定
无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择－外植体灭菌－接种－培养等基本过程。 培养物的增殖：腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖；原球茎增殖
腋芽增殖其特点是：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。
不定芽增殖特点：繁殖系数高，遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。 诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。
胚状体增殖特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术
愈伤组织增殖其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁
生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，
移栽要抓三个关键：①水分的平衡（不要失水过多）②温度和光照（不能太高）③光合能力逐步形成或加强
提高移栽成活率的技术措施①移栽前的工作a、培养瓶生壮苗b、炼苗：将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为10—30D。②移栽时应注意的问题a、防止菌类滋生：①苗底部培养基要洗干净；②杀菌剂处理苗的根部 ；③定时用杀菌剂处理种植基质b、保持小苗水分供给平衡：在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件（90%），使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当5—7d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。c、移栽时选择合理的种植基质：基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。d、注意一定光照，温度条件
应用领域
（1）珍稀植物资源和育种原始材料，如工程植株、果树芽变分离
（2）经济效益高，但难于繁殖的植物，如名贵花卉
（3）用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。
（4）用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。 （5）繁殖销量大，但用常规的方法难以满足数量上需要的植物，如草皮。
当前脱除植物病毒的方法有：茎尖培养脱毒法；热处理脱毒法；微体嫁接离体培养脱毒法；珠心组织培养法；愈伤组织脱毒 （一）、茎尖脱毒 1、茎尖脱毒的依据。
病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。
2、茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 （1）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其在体内的分布
（2）.母体植株的选择和预处理：材料的品种典型性；植体健康程度选择；高温预处理 （3）、茎尖的剥离 （4）. 脱毒效果检测 (5).脱毒苗的保存与繁殖 (二)热处理脱毒法 1、原理
热处理不能杀死病毒，能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力；热处理可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。 依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。
（三）微体嫁接离体培养脱毒法
（四）珠心组织培养法珠心组织与维管系统没有直接联系，而病毒一般认为是通过维管组织传播的，因此珠心组织培养可获得无病毒植株
（五）愈伤组织脱毒
通过愈伤组织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能：
（1）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。
（2）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰退或丢失
（3）愈伤组织产生抗性变异细胞。
13 花药和花粉培养（重点在概念及花粉与花药培养的差异） 花药培养(anther culture) 概念
把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.
? 花药和花粉培养：在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像
体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体
发育途径”或“雄核发育”。
2、花药培养的基本程序是：
外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养-移栽
（1）外植体的选择
基因型的选择：应选择那些容易培养成功的材料来做。
供试材料的生理状态： 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。
花粉的发育时期：单核花粉 — 双核花粉为最适期 (2)花药预处理 A低温预处理
? 低温预处理的作用机理，学者们提出以下几点：
? 1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有
丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。
? 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。
? 3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内
薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。
? 无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生率。 B热处理
C、离心预处理 D乙烯利预处理
E甘露醇预处理：可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育途径。 (3)外植体的消毒 （4）接种
（5）培养基及培养条件 用的基本培养基：H 、C17、MS（Murashigc & Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 附加成分：蔗糖, 植物生长调节物质
培养条件－温度和光照：不同植物对温度的要求不同， 光照：先弱后强 （6）移栽
（7）花粉植株的倍性及染色体加倍技术
花粉植株的倍性鉴定，最可靠的方法是对茎尖或根尖细胞进行染色体记数。
染色体人工加倍最有效的方法是用一定浓度的秋水仙碱处理单倍体植株的生长点或分蘖节。
3影响花药培养的因素 ①基因型 ②发育时期
③植株的生理状态 ④预处理
⑤培养基和培养条件
⑥花药的接种密度（密度效应）
⑦培养的方法与方式：固体培养、液体培养（Ficoll）、双层培养、分步培养、条件培
4、花药培养中单倍体形成的途径 A、通过胚状体形成单倍体植株 B、通过愈伤组织形成植株
高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利于胚状体的诱导。 通过愈伤易产生混倍体
5、花药培养的意义 a、缩短育种年限
常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5—F6代能得到纯合后代。 用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）。这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可缩短育种年限3—4个世代。 b、提高选择效率
F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因可以得到充分表达。单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。
6、现阶段花药培养存在的问题①诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%，低的只有百分之几，千分之几
②体细胞（花丝、药壁、药隔）干扰问题 ③倍性变异
④药壁毡绒层细胞对花粉发育的作用，如何用合成培养基代替毡绒层的作用，还不十分清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性。 ⑤白化苗问题
花粉培养(pollen culture) 概念:也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.
优点（与花药培养比）：
a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。
b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。
c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。
? 花粉培养与花药培养两者的异同点
? 培养目的相同，均获得小孢子植株。
? 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。
? 花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过
程；单倍体产量高。但技术更复杂。
2．花粉培养的一般方法 ①预处理或预培养 ②花粉粒的游离
分离花粉粒，应达到以下标准
a：成活率较高，发育齐整 b：达到一定的数量 c:无菌，无杂质 常用的分离方法有： A是自然散粉法 B机械分离花粉粒 ③．培养方法
3、影响花粉培养的几个关键
A、在培养前分离的花粉应多次洗涤，否则其生长和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只能形成愈伤组织
B、冷处理已广泛用来提高花粉雄核发育的频率
C、培养基中增加蔗糖和肌醇的浓度能明显提高雄核发育的频率。
14 植物胚胎培养（重点在幼胚培养的生长方式）
? 胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。
? 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚
珠培养、子房培养。
? 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括： 受精以后的胚珠子房培养 未受精胚珠和子房
胚胎培养的意义和类型
A 克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 B 打破种子休眠，缩短育种年限。 主要有以下两种：
（1）使种胚发育不全的植物获得后代。例如天麻、兰花种子成熟时，胚只有6-7个细胞，利用离体培养可以打破休眠提早萌发。
（2）使含抑制性物质不发芽的种胚发芽。苹果属离体胚培养48h即可萌发，而用种子则要9个月
C、使生活力低下或无生活力的种子萌发 D、使柑橘类植物合子胚正常发育 E、获三倍体或单倍体植株
F、快速繁殖特殊植物(椰子，山楂） G、用于基础研究
研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚乳生长发育及形态建成过程。
1、胚培养的概念与类型
概念：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法