常用质膜稳定剂有：葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl?2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid， 2-( N-吗啉)乙烷磺酸 作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调节pH值。 16.1.3 Purification of the isolated protoplasts
? 酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未
解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体。所以要进行纯化。 ? 净化的方法：
A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um）（过滤法） B、清除较小的物质： 1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法
影响原生质体活力的因素
? 分离材料的生理状态
? 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 ? 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 ? 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
16.1.4 原生质体的培养 一、原生质体的培养基 二、培养条件
三、原生质体培养方法
五、原生质体的发育与植株再生
? 细胞壁再生 ? 细胞分裂与生长
? 愈伤组织形成与分化 ? 植株再生
16.2体细胞杂交
? 体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起随后导致
两个细胞核物质融合的技术。
? 理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源,这对于种质资源
的开发和利用具有深远的意义.
A.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供有效途径;
B.体细胞杂交产生的杂种,细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中，双亲的叶绿体、线粒体、DNA、亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
? 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：
? 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。
? 非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活
后再进行融合，它可以分为几种：
16.2.1融合方法 1.盐类融合法
最早应用的诱导融合的方法。常用的盐类融合剂有：硝酸盐类、氯化物类、葡聚糖硫酸盐类。
优点：对原生质体的活力破坏力小 缺点：异核体形成的频率不高 2.高Ca+、高pH融合法
高Ca+诱导融合，Ca+浓度达到0.05mol/L使融合效果好
高pH能使质膜表面特性改变从而促进融合。烟草原生质体，理想的pH在9.5-10.5 优点：能获得较高的融合频率
缺点：对有些原生质体系统，高pH可能产生毒害 3.PEG诱导融合法
PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
PEG、高Ca2+、高pH相结合的融合法
此法被认为是植物原生质体融合最好的一种方法
2、电融合法：交流电使原生质体排成串珠，直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿
? 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点： ? 一是不存在对细胞的毒害问题； ? 二是融合效率高；
? 三是融合技术操作简便。
? 电融合仪的结构特点： ? 一是交变电场部分； ? 一是高频直流电击部分。
? 电融合的基本过程：
? 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过
原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
? 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，
从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
? 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电
场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
电融合法原理
? 交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠
? 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交
流
16.2.2 原生质体融合的过程
? 包括3个主要阶段：
? 1、凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；
? 2、在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连
续状态，或是出现桥；
? 3、由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。 16.2.3影响原生质体融合的因素
? 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞
融合的首要条件。
? 其次，融合方法首选电融合、如果没有条件进行电融合，可以考虑PEG融合 ? 其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 16.3 杂种细胞的筛选 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。
植物细胞筛选方式
1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。
2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。
3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。
4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 16.4 体细胞杂种的鉴定
形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。
分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
体细胞杂种的特点
? 形态上的趋中性 ? 变异幅度大 ? 非整倍性
? 双亲性状的共显性 ? 偏亲现象 体细胞杂种的遗传特性
? 1．细胞分裂与染色体丢失 2．基因转移与性状表达
3．体细胞杂种遗传上的不稳定性