（1）成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。
（2）幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。
幼胚培养的关键技术： ①取材
取材时期 大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体）以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。 ②幼胚剥离
胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。 ③培养条件的控制（是否需要特殊处理）
剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。
（2）幼胚离体培养的生长发育方式
①胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。 ②早熟萌发(early mature sprouting)
幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发）。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
③愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。
（3）离体幼胚培养的影响因素
①培养基
胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。成熟胚的培养基有：Tukey、White等。未成熟胚有：Rijven、Nitch、MS等。
培养基的渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调节主要依赖糖。常用的是蔗糖，不同发育时期的胚要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小糖浓度要求越高。确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象，以确定等渗溶液的浓度。 ②附加物
③环境条件：对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照条件有利于幼胚发育。
培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。
④培养材料：植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。显然，材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。
子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。
? 授粉前子房培养是为了获得孤雌生殖的单倍体植株，适用于那些胚囊分离特别困难
的植物；
? 授粉后子房培养适用于那些获得种子特别困难，胚分离不易操作的植物，以获得种
子或果实或植株。
1．材料的选择： （1）品种间的差异；（2）胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊期的子房培养具有较高的诱导频率。
诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些，分化培养时蔗糖浓度要低一些。 3.接种方式
主要考虑两个方面的问题：极性；营养吸收 花柄直插比平放效果好
影响胚乳培养的因素 （1）胚乳的发育时期：
胚乳发育时期大致可分为早期、旺盛生长期和成熟期。旺盛生长期为最佳时期，这时的胚乳细胞处于细胞形成期并保持旺盛的分裂能力。 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数 （2）基因型
（3）培养条件：常用培养基是MS和White，需要附加水解酪蛋白和酵母提取物。在诱导期一般需要高浓度的生长素、较高的pH，分化期需要较高浓度的细胞分裂素。 （4）胚因子 ：胚对胚乳的培养有一定的影响
4．胚乳培养的形态发生
? 愈伤组织形成
最适发育时期的胚乳在离体培养条件下经过一定时间即可形成愈伤组织。
? 直接进行器官分化
污染的含义：（重点污染的途径及污染的预防）
指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。 污染途径： （1）．外植体带菌 （2）．培养基及接种器具灭菌不彻底 （3）．接种操作时带入 （4）．环境不清洁 污染的预防措施：
A、 防止外植体带菌
（1） 选择好外植体采集时期和采集部位 ● 外植体采集以春秋为宜；
● 优先选择地上部分作为外植体； ● 阴雨天勿采，晴天下午采集；
● 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。 （2）室内或无菌条件下进行预培养。
（3）外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌 B、保证培养基及接种器具彻底灭菌
1． 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口 2． 检查封口膜是否破损
3． 扎瓶口要位置适当，松紧适宜 4． 保证灭菌时间和高压锅内温度 5． 接种工具用前彻底灭菌
6． 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌 C、操作人员严格遵守无菌操作规程 D、 保证接种与培养环境清洁 （1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗
（2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒
（3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前15—20min打开风机，风速调整到20——30m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒 （4）定期对培养室消毒，防止高温
人工种子的概念（重点在概念、包埋的方式及人工种皮的要求）
狭义 的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 广义 而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体
目前研制的人工种子的结构：体细胞胚、人工种皮、人工胚乳 人工种子制备的技术要点 一．繁殖体的处理
体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。
微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。
芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。
二．繁殖体的包埋 1、包埋介质的要求：
首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体
在生产、运输和种植操作中的安全。
同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。
此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。
2、常用的人工胚乳液配方有两种：
MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物； SH（0.5×）培养基加入1.5%的麦芽糖。 3、包埋的方法
主要有液胶包埋法、干燥包埋法 和水凝胶法 等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬 浮在一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。干燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进行包埋的方法。
4、以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：
在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。（添加糖、防腐剂、抗生素、农药等，防止病虫害侵染。）
将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经20－30min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子， 用无菌水漂洗20min.以终止反应。
海藻酸钠易失水干缩，为克服此弱点，采用二重结构，即在胶囊中包埋培养液、保水剂，使体胚悬浮于培养基中，为防止发芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。 三．人工种皮的装配 理想的人工种皮应该是：
具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 配制简单易行，成本低。
人工种子还在继续研究中，目前还不能大面积用于生产，因为还存在着难题：体细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种皮还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚待解决；人工种子工厂化生产配套设施、及种子成本过高等。这些问题一旦解决，人工种子的应用将会展现广阔前景。
第16章 植物原生质体融合技术（重点在原生质体的概念、原生质体的制备中的影响因子及原生质体融合的常用方法及原理） 1、Protoplast 原生质体
? A cell from which the entire cell wall has been removed
? Isolated protoplasts have been described as \cell wall has
been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed.
2、protoplast culture：
Protoplasts isolated from a variety of species can be placed in the appropriate medium and growth conditions. The protoplast can be induced to regenerate a cell wall and grow into a callus from which plantlets generate 3、Reasons for protoplast culture
（1）Protoplasts can be induced to fuse to produce a hybrid plant, which cannot be produced by
conventional plant breeding due to incompatibility（不亲和） （2） Isolated protoplast are capable of ingesting 摄取\material includes the introduction of nuclei, chloroplast, mitochondrion DNA, plasmids, bacteria and viruses
3）Protoplast can be used to study wall synthesis and deposition 沉积 （4）Protoplasts can be studied as single cell systems
16.1 Protoplast Isolation
16.1.1 Method for plant protoplast isolation. （1）Mechanical isolation of protoplasts （2）Enzymatical preparation of protoplasts 16.1.2 影响原生质体产量和活力的因子
1、材料的来源：无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶；温室或生长室栽种的植物；培养细胞 2、前处理：A、材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射；B、消毒；C、保证酶解充分进行，促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中。 3、酶处理
? 分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是细
胞间的果胶质降解，前者是消化细胞壁纤维素。
? 对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能还需要半纤维素酶.比如:大麦的糊
粉细胞以纤维素酶处理以后并不能把原生质体释放出来,这是因为在原生质体周围还留下一层抗纤维素酶的壁,这类细胞称做原生质球,只有用半纤维素酶处理才能把它们剩余的壁除掉.
酶处理的效果： 酶浓度：植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
酶解时间\\酶解温度：酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
酶液pH值：4.7-5.8；纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.4~5.6 4、渗透压
渗透剂：常用的两种系统为
? ①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40~0.80mmol
／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
? ②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生
理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
? 另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用
在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
5、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。