3.有机溶剂沉淀法
? 作用机制:竞争性破坏水化膜，降低介电常数；
? 可保持活性的处理条件：低温操作；沉淀完全后尽快分离
? 低温时，用丙酮脱水，还可保存原有的生物活性，但用乙醇脱水，时间较长后可使蛋白质变性。用70％酒精消毒就因其能更好地扩散到整个细菌的体内，使蛋白质变性沉淀。比70％ 稀的酒精，沉淀力太弱，95％的酒精，吸水力强，与细菌接触时细菌表面的蛋白质立即沉淀，因此酒精不能继续扩散到细菌体内，不能使细菌死亡。
（二）沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
2+2+2+
1 重金属盐沉淀法：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，可与重金属离子如ZnCu Pb 3+
Fe等作用，产生重金属蛋白盐沉淀；如铅盐及汞盐在NaoH溶液中皆可使蛋白质沉淀；铅中毒或汞中毒时，可服蛋白质使与该重金属结合呕出，有解毒作用。 2 生物碱试剂沉淀法（除蛋白作用）：生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸和三氯醋酸等皆能沉淀蛋白质
? 其沉淀原理是：一般生物碱试剂皆为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电荷的酸根相结合，成为溶解度很小的盐类；
? 临床化验常利用此类试剂沉淀血中的蛋白质(用磷钨酸、三氯酯酸)以制得血滤液，或用苦味酸 检验尿中的蛋白质。 3 热凝固沉淀法
4 抗体对抗原蛋白质的沉淀：
? 抗体蛋白质遇异体的特异性抗原蛋白质即起沉淀(或凝聚)，使外来蛋白质失其生物作用； 这就是免疫注射(打预防疫苗)的科学依据；关于抗体沉淀抗原的方式，研究认为是由于抗体蛋白质同抗原蛋白质两者分子结构上的互补性。它们之间的结合是以抗原为模板，抗体折叠在模板上而以氢键相连接，产生沉淀； 抗原—抗体反应有种属专一性。即一种抗体只能对—种特定的抗原起作用，因此，通过抗原—抗体反应，可以鉴定生物的种属。 四．蛋白质的变性作用与复性 （一）蛋白质变性的概念
天然蛋白质受物理或化学因素的影响，有序的空间结构被破坏，从原来有秩序的紧密卷曲结构变成无秩序的松散伸展状结构，致使生物活性丧失，并伴随发生一些理化性质的异常变化，但一级结构并未破坏。这就是蛋白质的变性作用。 （二）变性的可逆性与复性
复性：某些蛋白质变性后可以在一定的实验条件下重新形成原来的空间结构，并恢复原来部分理化特性和生物学活性，这个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。 ?可逆变性：变性条件除去后仍可恢复天然状态的变性。 ?不可逆变性：变性条件除去后不能恢复天然状态的变性。 （三）变性因素及作用机制
1 变性理论：蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规则的紧密排列方式因氢键及其他次级键的破坏而变成不规则的松散排列方式。 2 变性因素及机制
（1）热变性：热变性的定义、热变性三个阶段、影响热变性的因素:温度、砂糖、 H+浓度、蛋白质含水量、电解质；
（2）浓酸、碱变性 （3）有机溶剂 （4）尿素 、胍 （5）重金属等（6）机械搅拌 （7）紫外线
（四）变性蛋白质的性质：溶解度降低、生物活性丧失、结晶能力下降、不对称性增加，黏度增加、呈色反应加强、容易被酶消化 （五）蛋白质热变性、沉淀及凝固的关系 ?蛋白质的凝固作用：蛋白质变性后，所得的变性蛋白质分子互相凝集或相互穿插缠绕在一起的现象成为蛋白质的凝固。 ?凝固作用分两个阶段，首先是变性，其次是失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮。
（六）蛋白质变性的应用 五．蛋白质的颜色反应
? 双缩脲反应：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物；双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应；蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物；通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。 ? 茚三酮反应
? 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应：蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物； 是有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨含酸的蛋白质所特有的呈色反应； 如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。
? 福林酚试剂反应：福林试剂中含有磷钼酸及磷钨酸；蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物(即钼蓝和钨蓝的混合物)；这一反应常用来定量测定蛋白质含量。
? 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应：米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸盐的混合液；蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色；酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，放酪氨酸及含有酷氨酸的蛋白质都有此反应。
? 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应：在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环；凡含有吲哚基的化合物都有这一反应；色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应， 不含色氨酸的白明胶就无此反应。 ? 坂口反应—精氨酸特有的反应：精氨酸分子中含有胍基，能与次氯酸钠(或次溴酸钠)及a --萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物；此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来定量测定精氨酸的含量。 六．蛋白质紫外吸收性质
一般蛋白质在280nm波长处都有吸收峰，利用这特异性的吸收，对蛋白质进行定性和定量检测。
蛋白质浓度（ mg/ml） =1.45A280—0.74A260
第六节 蛋白质的分离、纯化与测定
一、 分离纯化的基本方法
1、盐析与等电点沉淀---根据溶解度不同的分离方法
2、离子交换层析法---根据电荷不同的分离方法——离子交换纤维素（ P56） 3、凝胶过滤法---根据分子量、分子形状不同的分离方法（ P57） 4、亲和层析---根据特异性亲和力不同的分离方法 5、高效液相色谱法（ HPLC）
6、疏水色谱
二、 蛋白质含量的测定
1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.福林酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法 三、 蛋白质的纯度鉴定
1、在不同pH条件下电泳为一条带 2、等电聚焦电泳为一条带 3、经纯化后的蛋白质应不失去生物活性 4、超速离心为单一沉降速度 四、 蛋白质分子量测定
1、凝胶过滤法
2、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
3、根据某一元素量已知，计算最低分子量
第二章 核酸
第一节 概述
一、核酸的定义：生物体内一类含有磷酸基团的重要生物大分子，是遗传变异的物质基础，是遗传信息的载体，在蛋白质的生物合成中起重要的作用。 二、核酸的分类：
DNA：遗传信息的主要载体 （1）主要在细胞核中；（线粒体、叶绿体、质粒） （2）存在于DNA病毒中； RNA： RNA在蛋白质生物合成过程中起着重要的作用 （1） 细胞质中的RNA
核糖体 RNA（ribosomal RNA, rRNA） 转运 RNA（transfer RNA ,tRNA）
信使 RNA（message RNA, mRNA） 小胞浆 RNA（scRNA, small cytosolRNA） 线粒体 RNA 叶绿体 RNA （2）细胞核中的RNA
hnRNA（ heterogeneous nuclear RNA） 不均一RNA snRNA（ small nuclear RNA），小核RNA； chRNA（ chromosome RNA），染色体RNA； （3）病毒RNA
第二节 核酸的化学组成 一、核酸的水解：（核苷酸是核酸的基本结构单位）
核酸?核苷酸（碱基—戊糖—磷酸）?核苷（碱基—戊糖）+ 磷酸 ?嘌呤和嘧啶（碱基）+ 核糖或脱氧核糖（戊糖） 二、核苷及核苷酸
1、核苷(戊糖+碱基):碱基和核糖的缩合物，以C-N糖苷键相连；
成苷位置：核糖C-1’与嘧啶N-1；核糖C-1’与嘌呤N-9。 核苷： 腺苷A，鸟苷G，胞苷C，尿苷U；
脱氧核苷： 脱氧腺苷dA，脱氧鸟苷dG，脱氧胞苷dC，脱氧胸苷dT； 2、核苷酸（核苷的磷酸酯） （1）核苷酸的结构 （2）核苷酸的种类：
核糖核苷酸：5’-AMP，5’-GMP，5’-CMP，5’-UMP； 脱氧核苷酸：5’-dAMP，5’-dGMP，5’-dCMP，5’-dTMP； （3）核苷酸种类的表示方法:Np和pN
如Ap表示3’-腺苷酸，pA表示5’-腺苷酸; 细胞内游离核苷酸及其衍生
物
3、含高能磷酸键的ATP类化合物（ATP是能量的直接供体） ①（脱氧）核苷三磷酸是合成 DNA和RNA的原料； ATP、GTP、CTP、TTP、UTP； ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；
②参加合成代谢：UTP--糖类合成、GTP--蛋白质合成、CTP--脂类合 ③环状核苷酸（ cAMP、cGMP）
第三节 核酸的分子结构
一、1.一级结构定义：指核酸分子中单核苷酸的连接方式和排列顺序。
连接方式----磷酸二酯键：由一个核苷酸的5’—磷酸基与另一核苷酸3-OH基脱水相连成3’，5’-磷酸二酯键 (-C3’-O-P-O-C5’-), 2.无分支
3.戊糖和磷酸构成其骨架；
l 3’ 末端----具有3’ -磷酸基(或羟基)的(写在右边) l 5’ 末端---具有3’ -磷酸基(或羟基)的(写在左边) 4.核酸的水解作用
（1）水解方式—碱法、酸法和酶法 （2）碱水解
RNA?2’-核苷酸 + 3’-核苷酸 DNA?DNA变性但不被水解 （3）酸水解
DNA?无嘌呤的DNA分子 （pH4）
DNA（RNA）?碱基+戊糖+磷酸（强酸高温） （4）核酸酶的水解作用
①核酸酶---水解核酸磷酸二酯键的酶 ②种类
③根据作用的底物分：
脱氧核糖核酸酶（DNase） ：(DNase根据底物不同分三种)
§ ssDNA(单链DNA)为底物、 dsDNA(双链DNA)为底物、 单、双链DNA均作用 核糖核酸酶（RNase）
④根据核酸酶对底物作用特点分： 核酸内切酶 核酸外切酶 核酸的高级结构
二、DNA的二级结构
1.①DNA分子的大小：碱基对（bp）、分子量； ②DNA的碱基组成特点
双链DNA分子中，A=T，G=C，A+G=C+T
碱基组成有种的特异性，无组织、器官特异性，且不受年龄、营养和环境的影响。 2.典型的双链DNA 二级结构
①DNA右手双螺旋结构模式的设计者：Watson与Crick，1953年。 ②设计主要依据：
对DNA分子X射线衍射图分析、碱基摩尔含量的比率关系、四种碱基的理化数据分析 3.经典的右手双螺旋模式要点(B型DNA） :
①两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴形成右旋的双螺旋结构,两条链之间通
过碱基间氢键连接。
②碱基位于双螺旋的内侧，碱基对平面垂直于中心轴，；磷酸和核糖在外侧，平行于中心轴；
③碱基配对：原则A=T，G=C；
④螺旋参数：每螺旋10对，螺距为3.4nm；双螺旋直径为2.0nm。 ⑤双螺旋有一条小沟和一条大沟；
例题1： 1 双链DNA分子量为3×107，计算： a DNA的长度b 含多少圈螺旋c 分子的体积（每对核苷酸残基平均分子量为618） 解： a L= 3×107/618 ×0.34 b n= 3×107/618 ÷10
c V=3.14 ×1.02 × 3×107/618 ×0.34
例题2: 已知某DNA溶液,碱基A占16%, 求其余碱基所含的比例。 解：因为， A=T， G=C 所以， T=A=16% G=C=50%-16%=34% 例题3：已知DNA分子的一条链碱基顺序为： 3’GCTACGA, 写出其互补链的碱基顺序。
4、DNA双螺旋结构的稳定因素
（1）氢键 （2）碱基堆积力 （3）离子键 5、其他双螺旋DNA类型的主要特征
A、C型：右手螺旋； Z型DNA：左手螺旋，12个碱基对； 三、DNA的三级结构
DNA的右手双螺旋结构进一步扭曲形成超螺旋结构：
A. DNA超螺旋 B. 共价闭合环 C. 卷饶不足的共价环 D. 松弛型的开环 RNA的二、三级结构
1、tRNA的二级结构：tRNA分子结构与其它RNA一样，都是单链结构，局部区域碱基配对形成双螺旋，约占40~70%，配对不象DNA那样严格，非螺旋区形成突环。研究发现tRNA多具有类似的二、三级结构。 2、tRNA的三叶草型二级结构模型
（1）tRNA分子量约25000，由70～90核苷酸组成，沉降系数为4S。 （2）为三叶草型，有四个臂（双螺旋区）和四个环（单链突起区） （3）含有许多稀有碱基 3、tRNA的三级结构：
（1）在三叶草型二级结构基础上，扭曲形成倒L型。
（2）氨基酸接受臂与反密码子环分别位于两端；分子上有两个双螺旋区；构象靠非螺旋区的碱基之间的氢键维持。
第四节 核酸的性质