生物技术综合大实验实验报告
GFP的分离与纯化
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GFP的分离与纯化
摘要： GFP，在生物领域应用广泛。本实验回顾了GFP提取纯化过程，包括细菌破碎、GFP沉淀、疏水过滤层析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤，来获得较纯的GFP，并运用SDS-PAGE来检测纯化效果。 关键词：GFP 应用进展 层析 SDS-PAGE
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequorin victoria)中分离出一种分子量为20kDa的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构；1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；1997年10月18~22日在美国New—Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。由此和Shimomura、Martin Chalfie共享了2008年诺贝尔化学。从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白，分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽。在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；发射光谱λ
max
=508~509nm。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影
响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内(pH7~12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。
GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的a、β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团(基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~490 nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10 min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。
GFP在生物领域的最新应用进展包括多种技术。（1）显像技术是利用荧光蛋白有多种颜色，且稳定、无毒，所以荧光蛋白可使得动物体内复杂的系统结构可视化；（2）一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂多，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，
借助于这一新技术，我们可以更深入地研究其感染方式；（3）由于荧光蛋白发光团的形成不具物种专一性，可发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光，所以转入宿主细胞后的荧光蛋白基因很稳定，对多数宿主的生理无影响，也是理想的报告基因；（4）荧光蛋白由于其独特的光信号转导机制，适于用作活细胞内的光学感受器。现在许多研究者将具有信号转导功能的分子识别位点结合到荧光蛋白分子上来设计成生物感受器；（5）利用GFP可显色的特点，我们还可对需要的物质进行筛选和纯化。由于新型病毒的鉴别特征有限，使得传统的抗体生产方法不能被有效运用，生产抗体便遇到了极大的困难，而GFP的发现及其在分子生物学中的应用解决了这一难题。
1.材料
1.1实验材料
含GFP融合质粒，Top10菌株 1.2实验试剂
溶液Ⅰ：50mM 葡萄糖，10mM EDTA ，25mM Tris-HCl，pH=8.0； 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS； 溶液Ⅲ：3M醋酸钾，2M 醋酸；
无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer，0.1M预冷 CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖，液氮，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶，苯基琼脂糖凝胶CL-4B，DEAE-纤维素；
Lysis Buffer（50mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0）； Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) ；
Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)； PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等。 1.3实验仪器
高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。
2.方法
2.1 质粒的提取 具体方法如下：
1.取1.5ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清液； 2.加100μl溶液Ⅰ，充分悬浮；
3.加200μl溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；
4.加150μl溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；
5.加800μl无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心8min，弃上清；
6.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；
7.加40μl TE Buffer溶解DNA，4℃备用。 2.2 感受态的制备及转化 具体方法如下：