条带清晰为止，观察记录 结果并拍照（本次实验中只染色45min，脱色1h左右）。
（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离 胶进行的SDS-PAGE）。
3.结果
3.1 挑取单菌落
在暗示中，用紫外灯照射下，发现单菌落发出绿色荧光。 3.2 细菌破碎中第一步离心后图片
细胞破碎后，蛋白质流出细胞外，在紫外照射下，整个细胞破碎液发出绿色荧光。
3.3疏水层析结果（借鉴第一组的图）
GFP峰
杂蛋白峰
疏水层析时，利用GFP和其他蛋白疏水性不同，分开从柱子里流出来。蛋白记录仪可通过出现波峰的形势记录蛋白的含量。GFP是较纯的蛋白，量大显示出峰值高；而杂蛋白量少出现不规则的峰。 3.4离子交换层析
GFP峰
离子交换层析利用是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进
行分离的一种层析方法。 3.5凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 3.6 SDS-PAGE结果图
其中样品1为细菌破碎样，样品2为疏水层析前离心样，样品3为疏水层析样，样品4为离子交换层析前离心样，样品5为离子交换层析后的透析浓缩样，样品6为凝胶过滤层析样。标出来的为GFP条带，大小在25~35kDa。
4.分析讨论
4.1实验评价及该进措施
从最后的电泳图可以看出，前3个样品出现明显的拖尾现象，整个条带都明亮，说明杂蛋白质较多，随着运用多种纯化技术，GFP纯度越来越高，故在样品4、5、6的条带中，蛋白的分子量主要在25~35kDa。图中提取的蛋白质纯度较高，所以本次试验较为成功。关于后续的进一步纯化，可采用结晶和重结晶方法来进一步提高蛋白质的纯度，并消除少量的杂蛋白和盐离子。
试验中存在一些缺陷，如电泳图看出，整体跑胶效果不好，原因是未使用浓缩胶，而且染色时间过短。
4.2 SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分？它们有什么作用？为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸？
SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有Tris-HCl，SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中Tris-HCl的主要作用是调节pH；SDS的作用主要是使蛋白质变性，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。
4.3常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-75其中的25、50、75指的是什么？这种凝胶的排阻极限分别为多少？
交联葡聚糖G-25、G-50、G-75中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。G-25的排阻极限为5000，G-50的排阻极限为30000，G-75的排阻极限为80000。 4.4离子交换层析后，交换剂用什么方法再生后可以继续使用？
先用NaOH溶液侵泡20-30min，洗完后抽滤，用蒸馏水洗至中性；再用酸洗20-30min，洗完后抽滤，用蒸馏水洗至中性。一般由于DEAE
—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用5mol/L NaOH浸洗，用去离子水洗至pH7.0左右，再转型，即可再使用。即用NaOH洗是为了出去杂蛋白，用酸洗是为了是柱材转型。 4.5简述疏水层析的原理和主要步骤。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
主要步骤：装柱；柱平衡，将疏水层析介质的疏水基团暴露出来；上柱；用离子强度较强的B液进行洗涤，洗去上样液中不吸附的组份，此外可将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上；再用A与B的混合液进行洗脱，由于A液离子强度比B液的低，所以可将之前吸附上的待分离样品组分洗脱下来。
参考文献：
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