? 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。
五、思考题
1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？
2．试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
3．什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 4．影响显微镜分辨率的因素有哪些？
5．根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
实验二 培养基的制备与灭菌
Ⅰ、培养基的制备
一、目的要求
1．明确培养基的配制原理；
2．通过对各类培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、基本原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 三、器材
1．溶液或试剂
? 琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；
? 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基的配方药品。 2．仪器或其他用具
? 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1．称量 2．溶解
3．调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。 4．过滤：趁热用四层纱布过滤。 5．分装 6．加塞 7．灭菌 五、思考题
1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？
3．配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？
4．有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时需要注意各种营养成分的比例？
5．你配制的高氏Ⅰ号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。
6．细菌能在高氏Ⅰ号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？
7．如果在马丁氏培养基分离真菌时，发现有细菌生长，你认为是什么原因？你将如何进一步分离纯化得到所需要的真菌？
8．马丁氏培养基的pH“自然”，根据你配制前二种培养基的经验和所学知识你认为此培养基灭菌后是应偏酸还是偏碱？为什么？
Ⅱ、灭菌与消毒
一、目的要求
了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
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二、基本原理
灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。 三、器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，手提式高压蒸气灭菌锅等。 四、操作步骤
1．火焰灼烧灭菌：如接种环或接种针的灭菌 2．干热灭菌 ? 装箱
? 灭菌：160～l70℃ 2h。
? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，自然降温至60℃后，取出物品。 3．高压蒸汽灭菌法（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）
? 装锅：先向外层锅内加入适量的水，并装入待灭菌物品。
? 加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。
? 灭菌：加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21℃时维持15~20min。 ? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。 五、思考题
1．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2．为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要地温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。 3．高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
4．在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 5．灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？
6．黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个更强？为什么？
实验三 微生物的分离纯化 Ⅰ、微生物的分离与纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的微生物分离纯化的基本操作技术。 二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 三、器材
1．菌种：米曲霉（Aspergillus oryzae）。
2．培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂：10％酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4％水琼脂。 4．仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
四、操作步骤
1．稀释涂布平板法 ? 倒平板
? 制备土壤稀释液 ? 涂布 ? 培养：将高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养2～3d。 ? 挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置于25℃和28℃下培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。 2． 平板划线分离法
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? 倒平板 ? 划线
? 挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。
五、思考题
1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2．如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。
3．如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出简明的实验方案（提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈）。
4．为什么高氏I号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉菌具有抗性的细菌，你认为应如何做？
5． 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？
6．接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？
Ⅱ、微生物的菌落形态特征
一、目的要求
了解各大类微生物的菌落形态特征。 二、基本原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、器材
1．菌种：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号合成培养基和马丁氏培养基等。 3．材料：无菌平皿，接种环(针)。 四、操作步骤
1．平板菌落培养
? 细菌、放线菌、酵母菌采用划线法； ? 霉菌采用点种法。 2．菌落形态观察
实验四 细菌的染色法 Ⅰ、细菌的简单染色法
一、目的要求
1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法； 2．初步认识细菌的形态特征；
3．巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 二、基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。 三、器材 1．菌种
? 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物
? 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）约24h营养琼脂斜面培养物 2． 染色剂：吕式碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。
3． 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
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2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。 4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。 5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6．干燥 7．镜检 五、思考题
1．你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2．为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
3．如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
Ⅱ、革兰氏染色法
一、目的要求
1．学习并初步掌握革兰氏染色法。
2．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理
根据细菌细胞壁结构和成分的不同，通过革兰氏染色法可将细菌分为G?菌和G-菌。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G?菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色（紫色）。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
? 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物
? 蜡样芽孢杆菌（B.cereus）12～20h营养琼脂斜面培养物 2． 染色剂：革兰氏染色液。
3． 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1．制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固体。 2．初染：结晶紫染色1～2min，水洗。 3．媒染：碘液覆盖约1min，水洗。
4．脱色：滴加95%乙醇脱色20～30s，立即水洗。 5．复染：滴加蕃红染色2min，水洗。 6．镜检：干燥后，置油镜观察 五、思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2．你怎么运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
3．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
4．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
5．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
实验五 放线菌和霉菌形态的观察
Ⅰ、放线菌形态观察
一、目的要求
1．学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；
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2．初步了解放线菌的形态特征。 二、基本原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性菌。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。 三、器材 1．菌种
? 细黄链霉菌（Streptomyces.microflavus） ? 青色链霉菌（ S.glaucus） ? 弗氏链霉菌（S.fradiae）
2． 培养基：灭菌的高氏Ⅰ号琼脂培养基。
3． 仪器或其他用具：平皿，玻璃纸，盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。 四、操作步骤
1．扦片法：在高氏Ⅰ号琼脂平板上划线接种，以无菌操作将灭菌的盖玻片以45o扦入琼脂内，倒置28℃培养3～5d后直接镜检。（观察时用暗光，先低倍镜后高倍镜，用0.1％美蓝染色观察，效果更佳。）
2． 玻璃纸法：将已灭菌的玻璃纸片铺在培养基平板上，压平玻璃纸后接种，倒置28℃培养3～5d后直接镜检。
3． 印片法：接种培养后，将平板上的菌苔连同培养基切下，菌面朝上放在载玻片上。另取一载玻片盖在菌苔上，按压（印片用力要轻）、火焰固定后再用石炭酸复红染色液染色lmin，镜检。 五、思考题
1．试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点
2．玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察？为什么？ 3．镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
Ⅱ、霉菌形态观察
一、目的要求
1．学习并掌握观察霉菌形态的基本方法； 2．了解四类常见霉菌的基本形态特征。 二、实验原理
霉菌可产生复什分枝菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，并由繁殖菌丝产生孢子。 三、器材 1．菌种
? 曲霉（Aspergikkus sp.）、青霉、根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2～5d的马铃薯琼脂平板培养物。
2． 培养基：土豆琼脂或察氏琼脂。
3．溶液或试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4．仪器或其他用具：无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U形玻棒，解剖针，解剖刀，镊子，50％乙醇，20％的甘油以及显微镜等。 四、操作步骤
1．直接制片观察法：用解剖针挑取已产生孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中洗去脱落的孢子，再用乳酸石炭酸棉蓝染色制片镜检。 2． 载玻片培养观察法
（1）培养小室的灭菌：先在皿底铺一张略小于皿底底圆滤纸片，放上U形玻棒、载玻片、盖玻片，灭菌烘干后备用。
（2）琼脂块的制作：切取0.5～1cm2的察氏琼脂块，移取到上述培养室的载玻片上。 （3）接种
（4）培养：先在平皿滤纸上加3～5ml灭菌的20％甘油，28℃培养。
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