（5）镜检 五、思考题
1．你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？
2．根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？
3．你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
实验六 酵母菌形态的观察
Ⅰ、酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目的要求
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 2．掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。 三、器材 1．菌种
? 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物。 2． 染色剂：0.05％和0.1％吕式碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。 3． 仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤
1．美蓝浸片的观察
（1）按无菌操作取少量酵母菌与0.1％吕式碱性美蓝染色液混合均匀，放置约3min后，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并用颜色区别死活细胞。 （2）染色0.5h后再次观察，注意死细胞是否增加。 （3）用0.05％吕式碱性美蓝染色液重复上述操作。
2．水－碘液浸片的观察：先滴加碘液后加水，取少量酵母菌混合均匀，盖上盖玻片观察。 五、思考题
1．吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因？ 2．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
Ⅱ、酵母菌子囊孢子的观察
一、目的要求
学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理
子囊孢子是子囊类酵母真菌有性生殖产生的有性孢子，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需一定条件，其中麦氏（McClary）培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 三、器材 1．菌种
? 酿酒酵母。
2． 培养基：麦芽汁琼脂斜面，麦氏琼脂斜面。
3． 溶液或试剂：5%的孔雀绿水溶液，0.5％的番红水溶液，95％的乙醇。 4． 仪器或其他用具：载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1．菌种活化：将酿酒酵母移种新鲜的麦芽汁斜面上，25～28℃培养24h，然后再转种2～3次。 2．产孢培养：将活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上，25～28℃培养约一周。 3．制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物涂片、干燥、固定。
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4．染色：孔雀绿染色1min。
5．脱色：用95％乙醇脱色30s，水洗。 6．复染：用番红复染30s，水洗。
7．镜检：油镜下，子囊孢子呈绿色，子囊呈粉红色。 五、思考题
如何区别酵母菌的营养细胞和释放出子囊外的子囊孢子？
实验七 微生物细胞大小测定和计数
Ⅰ、微生物细胞大小的测定
一、目的要求
1．学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法； 2．增强微生物细胞大小的感性认识。 二、基本原理
采用目镜测微尺和镜台测微尺测量微生物细胞的大小。测量时，将目镜测微尺放在接目镜中的隔板上，由于目镜测微尺每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。但由于显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。 三、器材 1．菌种
? 藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片； ? 酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2．仪器或其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1．安装目镜测微尺 2．校正目镜测微尺
两重合线间镜台测微尺格数?10?m目镜测微尺每格长度?两重合线间目镜测微尺格数3．菌体大小测定
测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出油镜下细菌直径或长、宽所占目镜测微尺的格数。再将所测格数乘以目镜测微尺（油镜）下每格代表的长度，即得该菌的实际大小。每个样品平行测定三次。 五、思考题
1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
Ⅱ、微生物的显微镜直接计数法
一、目的要求
1．明确血细胞计数板计数的原理；
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理
血球计数板的计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
由于每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，因而使用血球计数板直接计数时，先要测定5个中方格中的总菌数A，然后求平均数，再乘以25或16，求得大方格中的总菌数，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。设稀释倍数为B，则： 1ml菌液中的总菌数＝A/5×25×10000×B或1ml菌液中的总菌数＝A/5×16×10000×B
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三、器材
1．菌种：酿酒酵母。
2．仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 四、操作步骤 1．制备菌悬液
2．镜检计数室：保证计数室无污物。
3．加样：用毛细滴管吸取少许酵母菌液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡。
4．显微镜计数：先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数（即80小格）。 5．清洗血球计数板 五、思考题
1．根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 2．某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。
Ⅲ、平板菌落法数法
一、目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、基本原理
微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。故又称活菌计数，一般用于生物制品检验以及食品、水源的污染程度的检定。 三、器材
1．菌种：大肠杆菌菌悬液。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3．仪器和其他用具：1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、操作步骤
1．编号：分别标明平皿和无菌水试管的稀释度。 2．稀释、取样 3．倒平板 4．计数
每毫升菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三个平板上的菌落平均数×稀释倍数 计数原则：
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 ? 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。 ? 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 ? 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中的微生物总数。 ? 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。
（3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。 （4）所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。
（5）所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。 五、思考题
1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？ 2．要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
3．试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
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4．当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
5．用倒平板法和涂布计数法，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
实验八 微生物的生理生化反应 Ⅰ、大分子物质的水解试验
一、目的要求
1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统； 2．掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 二、基本原理
微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）将大分子物质的分解过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 三、器材 1．菌种
? 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌。
2． 培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管 3． 溶液或试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液。
4． 仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。 四、操作步骤 1．淀粉水解试验
制成淀粉培养基平板后，将平板分为四个区域，划线接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌后置于37℃培养24h。观察各细菌的生长情况，并滴加少量碘液于平皿中。若菌苔周围有透明圈，说明水解反应阳性。透明圈大小可初步判定该菌水解淀粉酶的能力强弱。 2． 油脂水解试验
制成油脂培养基平板后，同样划线接种上述四菌株，置于37℃培养24h后观察各细菌的菌苔颜色，若出现红色斑点，则为脂肪水解阳性。 3． 明胶水解试验
在明胶培养基中穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌，置于20℃培养2～5d后观察液化情况。 4． 石蕊牛奶试验
接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于石蕊牛奶培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性为紫色，而被还原时为白色。 5． 尿素试验
接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于尿素培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。尿素酶存在时为红色，否则为黄色。 五、思考题
1．你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2．不利用碘液，你怎么证明淀粉水解的存在?
3．接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ 4．解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ 5．为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？
Ⅱ、糖发酵试验
一、目的要求
1．了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用； 2．掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 二、基本原理
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。有些细菌分解某种糖能产酸产气，而一些细菌只产酸不产气。如本次试验的大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；而普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变黄色（pH5.2），气体的产生可由倒置的德汉氏
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小管中有无气泡来证明。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌，普通变形杆菌斜面各一支。
2． 培养基：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）。 3． 仪器或其他用具：试管架，接种环等。 四、操作步骤
取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，分别接种大肠杆菌和普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。置于37℃培养24～48h后，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 五、思考题
假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
Ⅲ、IMViC与硫化氢试验
一、目的要求
了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道鉴定中的意义和方法。 二、基本原理
IMViC是吲哚、甲基红、伏－普和柠檬酸盐四个试验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌，产气肠杆菌。
2．培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。 3．溶液或试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂等。 四、操作步骤 1．接种与培养
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验）置37℃培养48h。 （2）将上述两菌分别接种于蛋白胨水培养基（吲哚试验）、葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验）及柠檬酸盐斜面培养基中，置37℃培养2d。 2．结果观察
? 硫化氢试验：观察黑色硫化铅的产生。
? 吲哚试验：培养2d后加入3～4滴乙醚和2滴吲哚试剂，产生红色环状物为阳性反应。
? 甲基红试验：往葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变红为阳性，变黄为阴性。
? 伏－普试验：葡萄糖蛋白胨水培养物内各加入5～10滴的40％KOH和5％α－萘酚溶液，用力振荡后，放入37℃温箱中保温15～30min，若培养物呈红色为伏－普反应阳性。
? 柠檬酸盐试验：观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。 五、思考题
1．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
2．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
3．为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？
4．说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？
实验九 微生物的诱发突变
一、目的要求
通过实验观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并掌握基本方法。 二、基本原理
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素，它使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二
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