向上约束性,而乡下无约束性)50~100u/ ml,换液时可以离心去上清,可以用PBS洗涤两一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事项同一般的培养.
小鼠成肌细胞C2C12和人横纹肌肉瘤A204细胞的消化传代方法
供大家参考:
1)细胞消化液的配制及存储:我采用的是0.25%Trypsin+0.05íTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分装成4-5ml/tube,于-20度冰箱中储存. 2)消化前的处理:当细胞生长至亚融和状态需要传代时,提前半小时将配好的消化液放在细胞培养孵箱中预热,同时将配好的高压无菌的D-Hank's液也进行预热.
3)消化细胞:将预热的D-Hank's液洗细胞2次,2ml/25cm2,然后再加入预热的消化液,作用3-5min,并反复振荡,镜下观察.当细胞被消化成单个圆球状时,加入等体积的培养基中止消化,然后反复吹打,将消化后的细胞悬液,全部吸出后置于离心管中离心,1000rpm,10min. 4)传代接种细胞:离心完毕后,弃去上面的上清,加入新鲜预热的培养基,并计数,按要求接种的密度接种到新的培养瓶中即可.
这种方法的优点是:细胞消化彻底,损伤小,接种均匀,易于控制密度等.
hepa1-6和p19细胞。
hepa1-6是小鼠肝癌细胞，p19细胞是小鼠畸形胎瘤细胞，前者须用10%胎牛血清的DMEN养，后者须用10%胎牛血清的FD养，且经常在传代初期出现生长状态不好，要反复洗涤后换液，多观察。
Ecv304细胞的培养
Ecv304细胞也很好培养．用含有10%小牛血清的DMEM培养，一般２－３天长到８０％即可传代，传代是吸去培基，，用ＰＢＳ冲洗，加入0.０5%的胰酶＋0.02%的EDTA，３７度消化１分钟，加含有10%小牛血清的DMEM终止消化，吸管轻轻打散细胞，然后加培基放入37度二氧化碳培养箱中培养即可． 小鼠肝癌H22体内传代的详细步骤：
1.腹腔种植小鼠肝癌H22细胞后第5-7天时，将小鼠颈椎脱臼处死，于75%酒精浸泡1-2分钟或腹部消毒。
2.于无菌条件下用5 号针头注射器抽取腹水，并置于10～50 ml离心管内，用生理盐水(NS)
10倍稀释，吸管充分吹打均匀，1 000 r/min-1离心5#ml 7 min，倾出上清，按一定比例加入生理盐水，配制成瘤细胞悬液5-10*10^7/ml，0.2 ml/只，接种到小鼠腹腔。 3.为简单起见，也可将抽取的腹水用生理盐水做简单稀释（1：2～1：4），0.2 ml/只，腹腔传代。
4.下次传代时，重复以上步骤即可。小鼠肉瘤S180腹腔体内传代同上。
H22小鼠肝癌细胞株
是腹水型细胞株，悬浮生长。液氮冷冻保存。使用时取出复苏，用1640加10%新生牛血清培养，三天后取液计数成1＊108浓度，取0.08ml注入小鼠腹腔，7天左右腹水可用，一般要低速离心去掉巨噬细胞等混杂细胞，腹水得到的细胞比培养瓶中生长的细胞活力高，皮下接种成瘤率为100％。本法传代可靠性高，细胞活力强，致瘤率高。
神经胶质细胞传代经验：
1、倒掉培养液,用D-HANKS洗两次
2、加入0.125％胰酶/0.02％EDTA（1：1），盖满瓶底为宜。
3、将培养瓶放置显微镜下进行观察，发现细胞间隙增大，突起回缩后竖起培养瓶，倒掉消化液。
4、用D-HANKS洗一次，此时动作要轻
5、加入完全培养液，轻轻吹打混匀，接种至培养瓶中。 注意：
1、0.125％胰酶/0.02％EDTA的PH值和温度重要，即PH值（7.5），温度 （37℃）
2、如果消化速度过快，细胞掉下来，也不要紧，加D-HANKS或完全培养液终止消化，离心1000r/min，10分钟即可 3、轻轻吹打
大鼠肝癌细胞系CBRH7919
是我国自己培养的细胞系，最初是用二乙基亚硝胺诱发的Wistar大鼠肝癌组织传代而成。此细胞系增殖力很强。
传代方法：细胞长到90%以上，弃培养液->0.25%胰酶消化->消化时间1.5-2min->吸弃胰酶->加入1640培养液，10%胎（小）牛血清->传代（一般一传三）
如胰酶消化时间增加，可通过离心沉淀细胞后加入培养液传代，但这样增加传代时间，而且该细胞系粘附性较强，离心后易形成细胞团，且不易分散。
293细胞
293贴壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下来，但这样下来的细胞容易聚成团，传代后形态不大好看。可以先倒掉培养液，以D-HANK‘S液轻轻冲洗，再加0.6ml 0.25%胰酶/0.01íTA，轻轻润湿细胞后即可弃去，置于镜下观察，很快即可见细胞变圆，加入适量完全培养基终止，轻轻吹打即可。这样细胞既不会消化过头，又极尽吹散。
膀胱癌 T24细胞（贴壁的）。
心得如下：
1、 T24长的非常快，传代一般1：5传，每4天需要再传。
2、虽然是永生化细胞，也一定不要等细胞100%汇合再传代，多次这样细胞状态不好，球形增加，还不容易洗掉。
3、要用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化好些，一般1分钟内呈球形，即可混悬细胞了。
4、培养液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。
步骤：吸净培养液， PBS洗2次，加消化液室温一分钟左右，要在显微镜下注意观察，不要过头，球形后，吸掉消化液，加1毫升培养液，吹打混匀，1：5传代。
SMMC－7721，肝癌细胞株：
1、 SMMC－7721开始长的比较慢，呈花瓣状，成片后迅速增殖，细胞由于过密开始变小，如果不及时传代，会清楚的看到细胞张成两层，下层细胞大一些，上次呈圆形，小。 2、3-4天可以传代，传代时稀释度视情况而定，一般1：3 - 5
3、用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化，消化时间较长，大约5分钟，当细胞过多时时间更长，建议分两次消化，既先消化下来的一部分倒出加培养液（培养液用10%小牛血清的1640)终止，剩下的细胞继续加消化液消化。
步骤：倒净培养液，胰酶洗1次，倒尽，加胰酶消化液置于37度，在显微镜下注意观察，细胞变圆后，倒掉消化液，培养液，吹打混匀，1：3-5传代。
293T,贴壁细胞：在消化传代过程中，步骤如下：
用滴管吸尽旧的培养液－＞用培养基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已预热）-＞显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞用滴管吸尽酶液－＞加入一定量的含血清的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液，放入培养箱。 可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。
HELF(人胚肺成纤维细胞),
这也是一种贴壁生长的细胞,所以传代培养时的大概方法没有什么不同.但这种细胞贴壁贴得不是很紧,所以消化过程中有几点注意事项(本人总结): 1.当倒出原有培养液时,最好将培养瓶反过来,即有细胞的面朝上. 2.如用EDTA消化,最好先让其消化3分钟,后每一两分钟看一次.
3.每次看时不要太过晃动瓶子,以防细胞成片脱落.如果细胞成片脱落了就比较麻烦了,因为细胞已经脱落,就不得不终止消化,但实际上细胞与细胞间的连接并没有完全断开,吹打也分不开,那样分出来的细胞也就成团,则不利于细胞贴壁及生长.
4.如果在终止消化前有细胞脱落,不要浪费,先加Hank's液终止消化,然后离心,收集细胞,再让其生长.
5.细胞生长状态好时,一般5-7天可以长满,其间换一次液就可以了.
6.但我也遇到过生长不太好的情况,细胞长了12天才长满,且其中有几天几乎没长或出现大量黑色死细胞团,这时不要放弃,只要活细胞不是太少,没有关系.之所以长的慢或有死细胞,大概是消化时EDTA的损伤造成的,细胞恢复活性需要一定时间,且一旦活性恢复,细胞将长得很快.
人肝癌BEL-7402细胞传代步骤：
1. 弃去旧培养液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻转培养瓶，使培养面朝上，直接倒掉培养液）。
2.PBS冲轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃PBS液。
3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，细胞解离程度以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。 4.直接加含血清的1640培养基（或血清)终止消化。
5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。
5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。 6. 用含10％小牛血清的1640培养液重悬细胞，按1：3传代！ 7.补加培养液至所用培养瓶容积的1/10为准。 8.送孵箱培养。
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代，
RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。 我得操作如下：
实验前将DPBS及DMEM加温到37度 使用Flask75培养瓶：
1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去 2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞 3.分入新的培养瓶；
4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
卵巢癌细胞SKOV3
贴壁生长，传代步骤： 1.倒掉旧培养液，尽量倒净。
2.如果是50ml的培养瓶，加入约1ml0.25％胰酶中和残留培养液，倒出。也可用D-HANKS
液洗一次，可以节约胰酶。
3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人体会，新开瓶（指分装的小瓶）使用的胰酶消化能力强，可以减少用量至0.5－0.8ml,已用较久的胰酶如用少了就不管用。
4.镜下观察，如果80％以上细胞都回缩变圆，立刻将培养瓶竖起，防止过度消化。 5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培养液5ml加入瓶内，按顺序轻吹打，如瓶底由模糊变透亮，说明细胞已从瓶壁吹离。
6.此种细胞生长较快，所以一般按1传5－6传代，按瓶数补足培养液，吹匀后分别接种到新瓶中。
7.根据培养液颜色变化所提示的酸碱度变化，一般2天左右换液一次。
人脐静脉内皮细胞株ECV304：在含体积分数为10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培养液，37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培养，3-4d换液传代一次。实验时采用对数生长期细胞。传代时先倒掉旧培养液，用pbs５ml洗两遍，再加入0.25%的胰酶+0.01íta，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后大约半分钟左右看一次，对着光源观察瓶底细胞黏附面是否有裂缝（如有则在显微镜下可见细胞之间出现间隙且有大部分细胞呈现圆形），倒掉，加入含低浓度血清培养液，然后吹打瓶底各处使细胞脱落。离心后去除上清液，加全培，再分４瓶，补加培养液。这样操作步骤可大大简化，不需要将培养瓶拿出拿进操作台了．
附:消化缓冲液(0.25%)胰蛋白酶：胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，调节至PH 7.6，定容至500ml，22um滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用