Liaoning Normal University 本科生
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（2012届）
毕业论文(设计)
中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选化学化工学院 药学 6班22号 20081153020024 于淼 王澈
2012年5月
目 录
摘要 ................................................................................................................................ 2 Abstract ........................................................................................................................... 2 Key Words:....................................................................................................................... 2 前言 ................................................................................................................................ 2 1抗菌肽概述................................................................................................................... 2 1.1抗菌肽的改造 ............................................................................................................ 2 1.2抗菌肽的影响因素..................................................................................................... 2 2材料与方法................................................................................................................... 3 2.1材料、试剂、仪器..................................................................................................... 3 2.1.1实验材料................................................................................................................. 3 2.1.2实验试剂................................................................................................................. 3 2.1.3实验仪器................................................................................................................. 3 2.2 方法 .......................................................................................................................... 3 2.2.1 Temporin-1CEa类似物的改造设计 .......................................................................... 3 2.2.2 采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定 .................................................. 3 2.2.3 通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性。 ................................. 3 2.3.2几种改造肽的α螺旋含量....................................................................................... 7 2.3.3 保留时间来表征改造肽的疏水性 ........................................................................... 7 2.3.4比较Temporin-1CEa及其改造肽对MCF-7细胞增殖的抑制率。............................. 9 2.3.5比较Temporin-1CEa及其改造肽对人红细胞的溶血率。 ...................................... 10 2.4讨论......................................................................................................................... 11 参考文献： ................................................................................................................... 13 致谢 .............................................................................................................................. 14
摘要：
为了研究中国林蛙的Temporin-1CEa改造肽的抗癌活性筛选，主要对Temporin-1CEa进行氨基酸残集替换增强其正电荷性，采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定，通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性，利用MTT方法检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对MCF-7细胞增殖的抑制率检测，采用溶血实验检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对人红细胞的溶血率检测。由以上方法可得到抗癌活性好，对人红细胞无毒的抗菌肽，具有一定的研究价值和实际意义。
关键词：
抗菌肽；Temporin-1CEa；抑制作用
Abstract:
Filter for Chinese forest frog Temporin-1CEa transformation of peptide anti-cancer activity, Temporin-1CEa replace amino acid residues set to enhance its positive charge, Determination of CD spectra measurement of several modified peptides of the α-helix content, To characterize the transformation of hydrophobic peptides by high performance liquid chromatography retention time, MTT assay and compare Temporin-1CEa and its analogs on MCF-7 cell proliferation inhibition rate detection, Hemolytic assay and compare the detection of Temporin-1CEa and its analogues on human red blood cell hemolysis rate. Anticancer activity can be obtained by the above method , non-toxic antimicrobial peptide human erythrocytes , Have certain research value and practical significance.
Key Words:
Anticancer Peptides; Temporin-1CEa; the inhibition effect
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中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选
前言
1抗菌肽概述
抗菌肽自1972年发现以来，一直受到人们的广泛重视。它在自然界中极其广泛地存在，从微生物、昆虫、动物、植物中，人们已经发现了超过1500种抗菌肽[1]。抗菌肽的作用也是非常的广泛，不仅可以抑制、杀灭细菌，而且具有抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、免疫调节等作用[2]。另外，由于抗菌肽特殊的作用机制，其杀灭细菌时，不易诱导细菌产生抗药性[3]。这些使得抗菌肽极有可能在未来成为一种代替抗生素的理想新药[4]。然而，大多数天然存在的抗菌肽抗微生物的活性较差，很难达到药用的要求。要提高其生物学活性，对其分子结构进行改造是一个可行的方法[5]。
1.1抗菌肽的改造
抗菌肽N端富含亲水性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；C端富含疏水性氨基酸残基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常酰胺化。这种两亲性是抗菌肽具有抗菌活性的关键原因之一。不同功能的抗菌肽含有的疏水氨基酸残基比例却大致相同，约为41%-49% 绝大多数抗菌肽第二位氨基酸残基是色氨酸，中间富含脯氨酸，多数氨基酸有由半胱氨酸构成的二硫键[6]。在某些特定位点，不同的抗菌肽也会表现出高度的一致性，这是某些抗菌肽具备抗菌活性所必不可少的。Wang等通过对抗菌肽数据库APD里收录的525种抗菌肽的分析研究，发现97%的抗菌肽包含50或更少数目的氨基酸残基，平均长度为18个[7]。其中最长的抗菌肽(AP00404)包含84个残基，而最短的抗菌肽(AP00027)仅有6个残基。抗菌肽的二级结构极其多样，仅从这个方面对其分类是非常困难的，但我们仍可大致将其分为四类：含有线性α-螺旋结构的抗菌肽，含有若干二硫键维持的β-折叠抗菌肽，含伸展片层结构的抗菌肽和环形抗菌肽对已知抗菌肽的统计结果表明，具有α-螺旋结构的占抗菌肽总数的14.63%，具有β-折叠结构的占0.76%，同时具有α-螺旋和β折叠结构的占2.28%，富含稀有氨基酸的抗菌肽占10.07%，而具有二硫桥的抗菌肽占32.31%，其余39.92%为未知结构的抗菌肽[8]。
1.2抗菌肽的影响因素
抗菌肽的生物活性是由其分子结构所决定的[9]。目前为止，大量抗菌肽的结构-活性分析研究揭示出了它们之间的一些关系[10]。研究表明，抗菌肽的正电荷数、两性分子结构、保守序列、α-螺旋、二硫键、铰链结构等是影响其活性的重要因素。大多数抗菌肽带正 电荷，细菌的外膜带负电荷 ，抗菌肽通过静 电吸引作用结合到细菌表面。所以，阳离子特性是绝大多数抗菌肽具有抗菌活性所必需的，正 电荷有助于低浓度抗菌肽在膜表面富集达到有效杀菌浓度 ，正电荷的多少则直接影响其抗菌活性的强弱。但抗菌肽正 电荷数和抗菌活性间也无绝对正相关性 。有实验表 明[11]，当正 电荷增加到一定数 目之后，继续增加正电荷数，抗菌活性就不再增加。这可能是因为正电荷过多使抗菌肽牢固结合在磷脂头部，从而降低了其穿膜效率；同时正电荷数超过一定临界值导致抗菌肽分子间静电斥力强于其与膜的静电引力 ，阻碍膜上抗菌肽分子的聚集和 穿膜孔道的形成，最终表现为膜裂解能力即抗菌活性下降。因此增加带正电荷氨基酸的数量,有助于提高杀菌活性。疏水肽对抗菌肽的影响是指抗菌肽含有约50 %的疏水氨基酸残基,其活性是亲水基团和疏水基团相互作用的结果[12]。疏水作用对其活性的
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中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选
影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val 数量实现的。由于疏水基团的存在,肽链在溶液中可以通过疏水作用形成多聚体,增加了对真核细胞膜的亲和力;同时也增加了抗菌肽形成两性α- 螺旋的能力,而α- 螺旋的增加也提高了抗菌肽的稳定性 。但是增加分子的疏水性,抗菌肽的抗菌活力和对哺乳类动物细胞的溶血活性同时增加,这是由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用。Ayman H 等发现,肽链疏水面的正电荷可能对抗菌肽的溶血活性有重要影响,他们将一种抗菌肽RTA3 疏水面的Arg 替换为不带电荷的Leu ,结果大幅增加了抗菌肽的溶血活性[13]。
2材料与方法
2.1材料、试剂、仪器
2.1.1实验材料：中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽Temporin-1CEa及其类
似物（LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3）（上海吉尔生化有限公司），MCF-7细胞,人类血红细胞,三氟乙醇（TFE），十二烷基磺酸钠（SDS）
2.1.2实验试剂：生理盐水，蒸馏水，胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），DMSO（沈阳联邦试剂公司），MTT（Sigma公司），DMSO，0.1%TFA 超纯水溶液、0.1%TFA 乙腈溶液；（深圳市佳德宇化工有限公司）。
2.1.3实验仪器：倒置显微镜，酶标仪，CO2培养箱，荧光酶标仪（Thermo）；Jasco-810
型圆二色光谱仪；UV-7504PC型紫外可见分光光度仪（上海欣茂仪器有限公司）；FA2004型分析天平（上海天平仪器厂）；恒温水浴锅, 超净工作台，高速台式冷冻离心机，
2.2 方法
2.2.1 Temporin-1CEa类似物的改造设计
由于Temporin-1CEa的阳离子性较弱，并且对红细胞的毒性作用较强。所以通过赖氨酸（K）替换Temporin-1CEa中的中性氨基酸残基，以及带负电氨基酸残基以增加阳离子性，并且相对改变疏水值。
2.2.2 采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定
参照Conlon J M等人的方法，将抗菌肽temporin-1CEa及其类似物样品分别溶于水、30mM SDS的水溶液、50%（v/v）三氟乙醇（TFE）的水溶液，使样品终浓度达到0.3 mg/mL。圆二色光谱测定采用Jasco-810型圆二色光谱仪，石英样品池光程为1 mm，灵敏度为100mdeg，分辨率为0.5 nm , 狭缝为3 nm , 时间常数为0.25 sec。扫描波长范围为190~240 nm，扫描速率为500nm/min，在25℃下进行测定。
2.2.3 通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性。
将DEAE-cellulose柱后收集到的各峰分别以0.25μm孔径的滤膜过滤备用。
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