中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选
三蒸水为脱洗液，以0.25μm孔径的滤膜过滤。色谱柱为TSK-G5000PW，柱温25℃，0.5ml/min恒流洗脱40min，最大保护压力1.0Mpa，进样量20μl，样品浓度10mg/ml。蒸发光散射检测器，气化温度45℃，压力3.5Mpa[11]。
2.2.4 利用MTT方法检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对MCF-7细胞增
殖的抑制率检测。
1.选取人乳腺癌细胞MCF-7，Temporin-1CEa及其改造肽为实验材料； 2.将MCF-7细胞消化，稀释，接入96孔板，每孔100μL细胞液，细胞密度为5×104，37℃细胞培养箱中，24h贴壁培养；
3.加入
0.1%TFA
溶解的肽溶液，使其终浓度分别为
2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM；
4.过1h后，加入MTT试剂，每孔10μL，遮光处理4h； 5.弃去每孔液体，加入150μL DMSO溶液； 6.使用酶标仪，在492nm处测出吸光度值。
2.2.5 采用溶血实验检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对人红细胞的溶
血率检测。
1. 抽取约3ml血液，静置过后分层，用吸管吸取上层血浆以及白细胞。加入等渗的生理盐水，约10倍量，摇匀，1500r/min离心约10分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤3-4次，直至上清液不显示红色为止，取所用的红细胞的体积，加入生理盐水，配制成2%的红细胞悬液。 2. 用生理盐水将抗菌肽配制成20mM 的母液备用。
实验中：用生理盐水逐级稀释抗菌肽，使抗菌肽的终浓度为400μM，200μM,,100μM,50μM,25μM； 按下表所示体积加入各试管
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试管号 终浓度（μM） LK1-1 LK1-2 LK1-3 LK1-4 LK1-5 阳性对阴性对照 照 25 50 100 200 400 5 995 1 10 990 1 20 980 1 40 960 1 20mM肽溶液2.5 （μl ） 生理盐水（μl） 997.5 2%红细胞悬液1 （mL） 蒸馏水1000 1ml 1 1 改造肽LK2（5），LK2（6），LK3以及Temporin-1CEa依次编号；
3.取洁净试管若干，依次按编号加入试验材料； 4.37℃水浴孵育1h
5.结果观察：将水浴孵育的各管溶液取上清，在分光光度计上，540 nm附近处，以蒸馏水为空白读取各管的OD值。
结果判断：用下式计算各试验管的溶血率％。
溶血率（％）＝（试验管吸光度－阴性对照管吸光度）/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度) ×100％[20]
2.3 结果与讨论
2.3.1 Temporin-1CEa类似物的设计
表2-1：Temporin-1CEa及类似物的序列
Temporin-1CEa螺旋轮模型
电氨基酸序列 荷数 Temporin-1CEa +3 FVDLKKIANIINSIFGK-NH2 LK1 +4 FVDLKKIANIINSIFKK-NH2 +5 FKDLKKIANIINSIFKK-NH2 LK2（5） +6 FVKLKKIANIINSIFKK-NH2 LK2（6） LK3 +7 FKKLKKIANIINSIFKK-NH2 分子量平均疏MW（Da） 水性 1905.3118 1990.48 2019.52 2003.57 2032.61 11.3 11.4647 10.8412 11.5353 10.9118 两亲性
0.744 0.750 0.755 0.750 0.750 页 第5
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LK1螺旋轮模型 LK2(5) 螺旋轮模型
LK2(6) 螺旋轮模型 LK3螺旋轮模型
图2-1：Temporin-1CEa及类似物螺旋轮模型
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2.3.2几种改造肽的α螺旋含量
LK1的CD色谱图 LK2(5)的CD色谱图
120120H2O100H2O 10080 80 TFE 50%TFE 50% 6060 404030mM SDS30mM SDS 2020
00190200210220230240250 190200210220230240250-20-20
-40-40
-60-60
-80 -80
wavelength(nm)wavelength(nm)LK2(6) 的CD色谱图 LK3的CD色谱图 140120 H2O120H2O 100100TFE 50% TFE 50?80 30mM SDS6060 30mM SDS4040 20 200190200210220230240250 0-20190200210220230240250
-20-40
-60-40
-80-60 wavelength(nm)CD(mdeg)wavelength(nm)图2-2：类似物α螺旋含量
改造肽LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3的CD色谱图显示：
1、在模拟细胞膜表面结构的50%TFE水溶液中的CD谱显示—— 190nm附近存在一个正峰，同时208nm和222nm附近存在两个负峰，这是代表α-螺旋结构特点的光谱图；
2、在模拟细菌细胞膜表面结构的30mM SDS水溶液中的CD谱显示-190nm附近存在一个正峰，同时208nm和222nm附近存在两个负峰，这是代表α-螺旋结构特点的光谱图；
3、而在纯水溶液中的CD谱显示-在波长很短的地方出现单峰，在198nm附近有一负峰，这表明肽以不规则卷曲的结构存在；
2.3.3 保留时间来表征改造肽的疏水性
洗脱条件：A液：0.1%TFA 超纯水溶液 B液：0.1%TFA 乙腈溶液
40分钟内B液从20%上升到50%
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CD(mdeg)CD(mdeg)CD(mdeg)
mAU100200100150mAUmAU
-5050000055-100190 nmvydac2012-1-4-4.dat1000
温度25℃
LK1 25.5150 LK2（5） 20.7635 Temoporin-1CEa 25.5178 0Retention TimeRetention TimeRetention Time1: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-26.dat1: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-0.dat551423.0555.028.0731090.011411333.1827.1840.2234.246027.298569.2112.3375.3677.3793.1934762954.4747.04.35215595.25.8356.5927.29631103.979.013872.9145.1137619.590101515101015中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选
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2020MinutesMinutes20Minutes25.51526.73127.45629.81331.7333025912.41004.41935377.4139.41415.263597.15.161101276.6175769810.715179330.27.1717.9848184588.48.1113953.39.190.0230629373.02407.0261.12521.523190.2212143.72.2223932.2314.3223.80824.27725.0772525303033.48395053043.66.35355134.17.373540353539.339404000050-50100100200100150-100mAUmAUmAU