2013年分子生物学实验技术实验报告
实验名称：口蹄疫病毒VP1蛋白的表达
姓名： 学号： 班级 成绩
一、实验目的
本实验从口蹄疫病毒核酸的提取、分离、纯化、鉴定等实验技术入手，通过DNA技术、RNA技术和蛋白技术实验技术的应用，训练学生掌握分子生物学的基本试验方法和操作技能，进一步巩固理解分子生物学的基础知识和相关理论，从而为毕业论文选题和开展分子生物学方面的研究项目奠定基础。 二、实验材料与器材
1、病毒样品：口蹄疫病毒强毒株和阳性口蹄疫冰帝VP1重组质粒
2、仪器设备：凝胶图像分析系统、PCR仪、恒温水浴锅、培养箱、高速台式离心机、超低温冰箱、漩涡混合器、微量移液器等
3、试剂：pMD -18载体、PCR胶回收试剂盒 ，反转录试剂盒等
4、溶液：LB液体培养基，电泳缓冲液，0.1mol/l Cacl2溶液，氨苄青霉素母液，10％SDS，10％过硫酸铵，1.5M Tris-HCL，1M Tris-HCL，考马斯亮蓝染色液，脱色液，电转缓冲液，包被液，显色液等 三、实验方法
（一）反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 1、口蹄疫病毒总RNA的提取
1.1将250μL液体口蹄疫病毒样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL预冷的冰RNAiso Reagent。 1.2 将样品剧烈混合后，在室温静置5分钟。
1.3 加入200μL氯仿，颠倒离心管混合两次，并剧烈震荡混匀，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5分钟。 1.4在4℃ 条件下，以12000×g 离心15分钟。
1.5将上层水相转移到一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少10分钟。
1.6在4℃ 条件下，以12000×g离心15分钟后，小心并尽可能地除去全部上清液。
1.7用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，4℃ 12000×g 离心5分钟后小心弃去乙醇。 1.8将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL无RNase污染的水（RNase-Free water）将RNA溶解并于-20℃保存备用。
（二）反转录
1、反应体系（10μl）如下：
组 份 5×Buffer dNTPs RNA酶抑制剂 下游引物 反转录酶AMV 提取的RNA 总体积
体 积 2μL 3μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 3.5μL 10μL
2、加完后的体系，轻弹混匀，瞬离。 3、反应条件：42℃，1小时。
4、完成以后进行下一步实验或者放-20℃保存备用。 （三）聚合酶链反应（PCR） 1、反应体系（25μl）：
组 份 ddH2O 10×PCR Buffer
dNTPs P1 P2 Taq酶 cDNA template
Totle
体 积 16.25 μL 2.5 μL 2 μL 1 μL 1 μL 0.25 μL 2 μL 25 μL
2、设立阳性对照组和阴性对照组。
3、加完体系后，轻弹混匀，瞬离，上PCR仪。 4、特异性反应条件为：
预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 1min
退火 55℃ 1min 30 Cycles 延伸 72℃ 1min 终延伸 72℃ 10min
（四）PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳 1、电泳缓冲液TBE（10×）的配制：
称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(PH 8.0) 20 mL，定容至1000mL。
2、1.0%琼脂糖凝胶的配制：
称取1.0g琼脂糖于三角锥形瓶中，加入10mL 10×TBE缓冲液，并加水定容至100mL,加热溶解后加入5μL EB（10mg/mL），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。 3、电泳检测：
取PCR产物5μL 于Loading Buffer 1μL混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μL DL2000 DNA Marker 作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。 基因克隆
（一）DNA片段与载体的连接 1、反应体系（10μL）：
组 份
Ligation SolutionI PCR回收产物 pMD18-T 总体积
体 积 5 μL 4.5 μL 0.5 μL 10 μL
2、反应条件：16℃，4小时以上。 （二）感受态细胞的制备
试剂的配制： 1、LB液体培养基：
称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠10g，溶解于800mL去离子水中，用氢氧化钠调PH至7.5，加去离子水定容至1L，高温高压灭菌20min。 2、0.1mol/L 氯化钙溶液：
称取1.11gCaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100mL,高温高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌。 3、无菌甘油：
取甘油100mL，高温高压即可。 操作步骤（无菌操作）：
1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种于2mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm，震荡培养过夜，作为一级种子。
2、将一级种子按照1:50比例无菌转接到5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm震荡培养约2-3小时，至细菌的OD600达到0.5左右。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5mL离心管中，冰浴30min。 4、4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
5、加入1mL预冷的冰的0,1mol/L CaCl2，轻轻重悬。悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，分装100μL/管，-70℃保存备用。 （三）连接产物的转化 试剂配制：
1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：
用灭菌的ddH2O将氨苄青霉素粉配成100 mg/mL水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，置-20℃保存备用。 2、Amp+抗性的LB液体培养基：
在LB液体培养基中加入1μL 100mg/mL的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。
3、Amp+抗性的LB固体培养基：
在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入1μL 100mg/mL的氨苄青霉素母液后，铺制平板。待培养基凝固后，于4℃保存备用。 操作步骤：
1、去-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μL，轻轻混匀，冰浴30min。
2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。
3、加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm-220rpm震荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。
4、4℃，4000rpm 离心5min，弃上清400μL，将剩余100μL菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12-16小时，至单菌落出现。 （四）质粒的抽提
操作步骤：
1、用灭菌牙签挑取单菌落于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃ 200rpm震荡培养12-16小时。
2、用1.5mL离心管收集1.5-5mL菌液，离心收集菌体，弃尽上清。（注：在1.5mL离心管中加入1.5mL菌液，离心收集菌体，弃上清后再加入1.5mL菌液，收集菌体，如此反复。）
3、加入250μL Solution I/ RNase A重悬菌体。
4、加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，使菌液变清亮。（注：混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘即可。）
5、加入350μL Solution III，轻轻颠倒混匀数次直至出现白色沉淀，12000rpm离心10min。
6、将离心后的上清全部转移到HB离心柱中，室温12000rpm离心1min。（注：此时HB离心柱置于收集管中。）
7、弃掉收集管中的液体，向HB柱内加入500μL Buffer HB，室温12000rpm离心1min。 8、弃掉收集管中的液体，向HB柱内加入700μL DNA Wash Buffer，室温12000rpm离