心1min。（注：目的是将Resin上吸附的蛋白质、盐等杂质洗脱。） 9、重复步骤8.
10、空柱12000rpm离心1min，以甩干剩余液体。（注：主要是去掉残余的乙醇，以利于DNA的溶解。）
11、将HB离心柱置于新的1.5mL离心管中，向柱中加入50-100μL 灭菌的去离子水，12000rpm离心1min，离心管管底即为质粒DNA，置于-20℃保存备用。 12、1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。
（五）重组质粒的酶切鉴定
1、反应体系（20μL）：
组 份 重组质粒 10× Buffer RcoR I BamH I ddH2O 总体积
体 积 5 μL 2 μL 1 μL 1 μL 11 μL 20 μL
2、反应条件：37℃，3小时以上。
3、结果检测：取酶切产物10μL与2μL Loading Buffer混合后，用1%琼脂糖凝胶电泳检
测，同时设DL10000 DNA Marker作对照。
外源基因在大肠杆菌中的表达
（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达
操作步骤：
1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将培养的细菌按1:50比例加入到5mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600在0.4-1.0之间（最好0.6，大约3小时）。
3、取1mL菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3小时。
4、分别取菌液1mL于1.5mL离心管中，12000×g离心30s，收获菌体。
5、用100μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀
后沸水浴5min。
6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。
（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
实验原理：
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率取决于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 试剂配制：
1、30%丙烯酰胺贮存液（30% (w/v) Acrylamide)：
丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，加入ddH2O充分搅拌溶解并定容至100mL，棕色瓶存于4℃。
2、1.5M Tris-HCl（pH 8.0）：
Tris-base 18.17g加ddH2O溶解，浓HCl调节pH至8.0，定容至100mL，4℃保存。 3、1M Tris-HCl（pH 6.8）：
Tris-base 12.11g加ddH2O溶解，浓HCl调节pH至8.0，定容至100mL，4℃保存。 4、10%SDS：
电泳级SDS 10.0g，加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调pH至7.2，定容至100mL。 5、电泳缓冲液（pH 8.3）：
Tris 3.02g，甘氨酸 18.8g，10%SDS 10mL，加入ddH2O溶解，定容至1000,mL。 6、10%过硫酸铵（AP）：
1g过硫酸铵，加入10毫升ddH2O，搅拌溶解。 7、2×SDS电泳上样缓冲液：
1M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0mL，β-巯基乙醇 1.0mL，SDS 0.4g，甘油 2.0mL，0.1%溴酚蓝 1.0mL，ddH2O 5.0mL。 8、考马斯亮蓝染色液：
考马斯亮蓝R-250 0.25g，甲醇45mL，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。 9、脱色液：
甲醇45毫升，冰醋酸10mL，ddH2O 45mL。
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置 1、安装电泳槽。
2、配制分离胶（12%）（10mL）:
组 份 ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED 总体积
体 积 3.3 mL 4.0 mL 2.5 mL 0.1 mL 0.1 mL 4.0 mL 10 mL
以上溶液混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。（凝胶完全聚合需30-60min）。
3、配制浓缩胶（5%）（3mL）：
组 份 ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶
1M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
体 积 2.1 mL 0.5 mL 0.38 mL 0.03 mL 0.03 mL 3.0 μL
总体积 3.0 mL
将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余的水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需要15-30min。
4、待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。
5、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，12000×g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。 6、上样：取10μL诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μL低分子量蛋白Marker作对照。
7、电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝至电泳槽下端停止。
8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6小时。 9、 脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
10、凝胶摄像和保存：将脱好色的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或者70%乙酸溶液中。 （三）Western Blot
实验原理：
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
试剂准备：
1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0mL，10%SDS 6.0mL，β-巯基乙醇 0.2mL，ddH20 2.8mL。
3、电转缓冲液：甘氨酸 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇 200mL，加ddH20定容至1000mL。
4、TBS（pH8.0）：Tris base 1.211g，NaCl 8.766g，加ddH20溶解后用HCl调节pH至8.0，定容至1000mL.
5、TBST：在TBS中加入终浓度为0.05% Tween-20即可。
6、包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g，溶于20mLTBST中。 7、显色液：DAB 6.0g，TBS 10mL，30%H2O2 30μL。 操作步骤：
1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞；真核细胞加匀浆缓冲液，机械或者超声波室温匀浆0,5-1min，然后4℃，13000×g离心15min，取上清液作为样品。
2、电泳：制备聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：?电泳结束后将胶条切割至合适大小，用点转移缓冲液平衡，5min×3次。?膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。?转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2在，转移1-2小时。转移结束后，断开电源取膜将膜取出做免疫印迹。
4、免疫反应：?用TBST洗膜，5min×3次。?加入包被液，平稳摇动，室温2小时。?弃包被液，用TBST洗膜，5min×3次。④加入一抗（按合适稀释比例用TBST稀释，液体必须覆盖膜的全部），平稳摇动，室温1min。⑤弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次。⑥加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用TBST稀释），平稳摇动，室温0.5-1小时。⑦弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次。⑧再将膜转入TBS中洗2遍，每次5-10min。⑨加