7、分别取正常菌落和可疑菌落行单纯药敏试验；
①在培养基中用接种针分别挑取正常菌落和可疑菌落分别用密集画线法接种于MH药敏培养基，使待检细菌在MH培养基上近似均匀分布。
青 丁 红 氯庆
密集画线 药敏纸片均匀贴在培养基上
青 丁 红 氯庆
药敏实验结果
②在含菌的MH培养皿中均匀贴上不同药敏纸片（氯霉素药敏纸片、庆大霉素药敏纸片、青霉素药敏纸片、红霉素药敏纸片、丁胺卡那药敏纸片），使药敏纸片呈梅花状分布。
③将MH培养皿放于37℃恒温培养箱18~24小时，并观察抑菌环大小，测量、记录抑菌环直径。 8、取可疑菌落做迁徙实验
①用灭菌过的接种环取可疑菌落，点状接种在普通培养基上。
②将普通培养基放于37℃恒温培养箱18~24小时，并观察记录有无迁徙生长现象。
七、实验路线及方法变更
粪便标本（1g±）
?
SS、MacConkey平板 ?18~24h 可疑菌落、正常菌落
? ? ?
Gram’s stain染色 初步生化 纯培养（SS或MacConkey平板） ? ? ?
镜检 系统生化 大肠杆菌质粒DNA抽提 ? ↙ ↘ ?
验证染色镜检在肠道 血清学检查 药敏试验 OD260/OD280比值测定 G-杆菌鉴别诊断价值 ? ?
单纯药敏试验 确定DNA纯度 ?
联合药敏试验
八、实验内容与预期目标
1、实验内容 ①培养基的制备
②粪便细菌标本的分离培养 ③可疑菌落的染色镜检 ④可疑菌落的生化反应 ⑤细菌的药敏试验 ⑥迁徙实验 2、预期目标
①掌握各种培养基的配置方法和鉴定
②学会湿热灭菌和高压蒸汽灭绝菌锅的使用方法 ③掌握肠道细菌分离培养方法和步骤 ④掌握肠道细菌的鉴定方法、鉴定要点和步骤 ⑤掌握K-B法细菌药敏试验
九、结果
1、肠道细菌在肠道选择培养基上的生长特点
肠道菌群在MacConkey平板呈粉红色的菌群，呈条状分布，且分布不规则均匀；在SS上呈乳白色点状生长，从一区到四区递减分布。具体情况见图13~图17。 2、可疑菌落的涂片、革兰氏染色、镜检
可疑菌落在显微镜下（油镜）看到为红色菌落，是革兰氏阴性菌，菌体两端钝圆，有明显的多形性，呈球型或丝状，分布不均匀，成团或成簇分布。具体情况见图25~图28 3、肠道细菌的初步生化反应
正常菌落的初步生化反应结果：产酸产气，动力实验为阳性；可疑菌落在KIA培养基中呈黑色分布，产硫化氢，培养基底部有小个空泡，在斜面上呈点状菌落分布，在MIU培养基中，细菌沿穿刺线放射生长，动力试验呈阳性。具体情况见图19~图21。 4、肠道细菌的系统生化反应
可疑菌落的系统生化反应结果是：甘露醇黄色呈阳性，，麦芽糖黄色呈阳性，七叶棕色呈阴性，枸橼酸盐绿色呈阴性，赖氨酸紫红色呈阳性，精氨酸浅棕色呈阳性，鸟氨酸淡黄色呈阳性，尿素黄色呈阴性，硫化氢黑色呈阳性，蛋白胨水红色呈阳性，纤维二糖蓝色呈阴性，VNPG黄色呈阳性。具体情况见图22~图24
5、肠道细菌的K-B法药敏试验
根据抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致），判断为敏感（S），耐药（R）或中介度（I）。用刻度尺量的抑菌圈如下，具体情况见图29~图32
氯霉素 (2.5cm） 庆大霉素 （R) 环丙沙星 (2.8cm）
红霉素 (R) 青霉素 （R) 6、可疑菌落的迁徙实验
可疑菌落在普通琼脂平板上可蔓延波纹状薄膜布满整个培养基表面，迁徙生长实验呈阳性。具体情况见图18。
肠道细菌分离培养与鉴定 图1：学生在普通实验室进行实验 图2：教师在实验室指导学生进行实验 图3：主要实验试剂 图4：主要实验试剂（KIA，自制） 图5：主要实验仪器-恒温培养箱、干烤箱 图6：主要实验仪器-高压灭菌锅 图7：主要实验仪器-半自动细菌生化分析仪 图8：主要实验仪器-定量PCR仪
实验结果 图9：主要实验仪器-5415D型速离心机 图10：主要实验仪器-Microfuge 18型高速离心机 图11：主要实验仪器-斜角式离心机 图12：主要实验仪器-水平式离心机
肠道菌群分离培养与鉴定 图13：肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况 图14：肠道菌群在SS、Mac培养基生长情况