附件 C
大肠菌群计数检验流程图
第一法 MPN计数法 第二法 平板计数法
附录4
大肠埃希氏菌计数
第一法 MPN计数法 1. 样品的稀释
1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min～2min,制成1:10 的样品匀液。
1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。 1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。 2. 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。产气者进行复发酵试验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。 3. 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC 肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。
4. 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 5. 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。 6. 鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR（甲基红）-VP试验和柠檬酸盐利用试验（详见生化试剂盒使用）。 5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋――或－＋－－。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附件D，表2），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。
第二法 平板计数法 1. 样品稀释
按第一法中的1进行 2. 平板计数
2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时 取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。
2.2 将10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。 2.3 平板菌落数的选择
选择菌落数在10CFU～100CFU之间的平板，暗室中360nm～366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性和阴性对照。 3. 大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
附件D 表2 大肠埃希氏菌最可能数（MPN）检索表 阳性管数 0.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 0.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 MPN 95%置信区间 上限 - 0.15 0.15 1.2 1.2 3.6 0.17 1.3 3.6 1.3 3.6 3.6 4.5 4.5 1.4 3.6 4.5 3.7 4.5 8.7 下限 9.5 9.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 0.10 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管数 0.01 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.001 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 MPN 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 ＞1100 95%置信区间 上限 4.5 8.7 8.7 8.7 8.7 4.6 8.7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 下限 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1000 1000 2000 4100 — ＜3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15 20 27 注1：本表采用3个稀释度[0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)]，每个稀释接种3管。 注2：表内所列检样量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g (mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。
附件E
大肠埃希氏菌计数检验流程图
第一法 MPN计数 第二法 平板计数法