附录5
沙门氏菌检验
1. 前增菌 称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的容器中，均质1min～2 min。若样品为液态，振荡混匀。如需测定pH 值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，于36℃±1℃培养8h～18h。 如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。 2. 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB 内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mL SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 3. 分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD 琼脂平板。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD 琼脂平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表3： 表3 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落形态 选择性琼脂平板 BS 琼脂 沙门氏菌 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 按照显色培养基的说明进行判定。 XLD 琼脂 沙门氏菌属显色培养基 4. 生化试验 4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。 4.2 用接种针挑取营养琼脂平板纯培养物，分别接种赖氨酸和赖氨酸对照管，36℃±1℃培养18h～24h。 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表4。 表4 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱酸酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 斜面 K K A A K 底层 A A A A K 产气 ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 硫化氢 ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 赖氨酸脱羧酶试验培养基 ＋ － ＋ － ＋/－ 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 非沙门氏菌 非沙门氏菌 初步判断 注： K（产碱，红色）；A（产酸，黄色）；产气（断层）；产硫化氢（变黑） ＋（阳性，）；－（阴性）；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。
4.3 当三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验的初步判断为可疑沙门氏菌属时，用接种环挑取（较大菌落取一半菌落，小菌落取一个）营养琼脂平板纯培养物，接种到3mL无菌水中，振摇制成约0.5麦氏浊度菌悬液，用无菌吸管接种于沙门氏菌干制生化鉴定盒（北京路桥）的9个圆孔中，每孔0.2mL菌悬液，盖上盒盖，于36 ℃±1 ℃培养。各生化反应的培养及结果见表5、表6。 注：将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。 表5 生化试剂盒（北京路桥）结果判定表 结果判定 试验项目 阴性结果 氨基酸对照 赖氨酸 脱羧酶 氰化钾对照 氰化钾 试验管不生长 试验管生长 培养后滴加2-3靛基质 黄色 玫瑰红色 大多数阴性 18h～24h 滴靛基质试剂，即刻观察。 尿素 甘露醇 蓝色或绿色 山梨醇 ONPG 不变色 黄色 黄色 大多数阳性 阳性或阴性 1h～3h和24h —— ------- 黄色或橙色 玫瑰红色或红色 阳性 18h～24h —— 18h～24h —— ------- ------- ------- —— 对照管黄色 试验管黄色 —— 对照管生长 阳性结果 —— 对照管黄色 阳性或阴性 试验管紫色 滴灭菌液体石蜡—— 对照管生长 不生长 生长 覆盖培养及表面 24h～48h 生长为 混浊 沙门氏菌生化现象 黄色 18h～24h 接种后需滴加2-3培养 时间 说明 备注 出现黄色即为阴性 表6 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 A1 A2 A3 硫化氢（H2S） ＋ ＋ － 靛基质 － ＋ － pH 7.2 尿素 － － － 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶 － － － ＋ ＋ ＋/－ 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 4.3.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表7可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。 表7 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2尿素 － － 氰化钾（KCN） － ＋ 赖氨酸脱羧酶 － ＋ 判 定 结 果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）
＋ － ＋ 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；－表示阴性。 4.3.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 4.3.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌。大部分沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 4.5 血清学鉴定 4.5.1 抗原的准备
一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。
4.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出2个约1 cm×2 cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 1.6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录6
金黄色葡萄球菌检验
第一法 金黄色葡萄球菌定性检验 1 操作步骤 1.1 样品的处理
称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤容器中，均质1min～2 min。若样品为液态，吸取25mL 样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 1.2 增菌和分离培养
1.2.1 将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。 1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18 h～24 h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。
1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 1.3 鉴定
1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5μm～1μm。
1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。 1.5 结果与报告
1.5.1结果判定：符合1.2.3、1.3，可判定为金黄色葡萄球菌。
1.5.2结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 2 操作步骤 2.1 样品的稀释
2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的容器内，均质1min～2min，制成1:10的样品匀液。
2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
2.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
2.1.4 按1.1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
2.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL 接种量分别加10倍系列稀释入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。 2.3 培养
2.3.1.1 在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养，45h～48h。 2.4 典型菌落计数和确认
2.4.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
2.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20CFU～ 200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a） 只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的 典型菌落；
b） 最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落； c） 某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落， 应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d） 某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但 其平板上的菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落； 以上按公式（1）计算。
e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU 之间，按公式（2）计算。 2.4.3 从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别按5.3.2做血浆凝固酶试验。 2.5 结果计算： 公式（1）： 式中
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