实验一 蔗糖密度梯度离心分离实验
一、实验目的
1.熟悉蔗糖密度梯度离心原理 2.熟练掌握蔗糖密度梯度离心操作技术 二、实验原理
溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。在超速离心技术中，样品的密度应该分布在溶液的密度梯度范围内。 三、材料、试剂及仪器 1.试剂
20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液；墨汁。 2.仪器
烧杯，普通离心机，试管若干。 四、实验步骤 1.梯度液的制备
（1） 制备出不同浓度的蔗糖溶液，浓度间隔相同，分别是浓度为20%、40%、60%、80%
的蔗糖溶液。
（2） 每个浓度量取相同的体积，按浓度依次减小的顺序逐个缓慢铺入离心管中，制成不
连续阶梯密度梯度。
（3） 此离心管在20-25℃静止2-3h，通过重力作用即成接近线性的蔗糖密度梯度液。若
用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5-1h。温度低时所需静置的时间较长，温度高的时候则较短。为减少对流，静置后应将离心管置于冰浴中备用。
2.蔗糖密度梯度离心
向已形成密度梯度的离心管中加入半滴墨汁，加入离心管中离心，3000r/min离心10min，观察实验现象。 五、结果与分析
蔗糖密度梯度离心和差速离心有什么区别？
实验二 双水相相图的制备
一、实验目的
1.了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势 2.掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法 二、实验原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。 双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ 三、材料、试剂及仪器 1.试剂
PEG400；硫酸铵。 2.仪器
漩涡振荡器、微量滴管装置 、电子天平。 四、实验步骤 1.双水相系统的制作
（1）精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
（2）精确称取PEG400液体0.7g于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
（3）按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。 序加水量 加(NH4)2SO4纯(NH4)2SO4纯(NH4)2SO4溶液累计PEG400(NH4)2SO4
号 （ml） 溶液量（ml） 新增量（g） 累积量（g） 总量（ml） 重量百分比 1 2 3 4 5 6 7 重量百分比 2.相图的绘制
以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。 五、注意事项
1.微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。
2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。
3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。
4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。 六、思考问题
1 双水相萃取中相图有何意义？
2 双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？
实验三 牛血清蛋白在双水相萃取系统中的分配
一、
实验目的
1.了解双水相萃取的原理和方法 2.双水相系统分离蛋白质的操作
二、
实验原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。 双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与而家铜离子结合生成紫色络合物的反应，双锁尿是由两分子尿素缩合而成的化合物在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红和络合物。因此具有两个或两个以上的肽键的化合物都有双缩脲反应，其颜色深浅和蛋白质含量成正比。可利用此反应进行蛋白质定性鉴别 （4） 材料、试剂及仪器 1、材料 牛血清蛋白 2 .试剂
Peg6000、硫酸铵、硫酸铜、酒石酸钠钾、氢氧化钠、蒸馏水。 2.仪器
离心机、离心管、烧杯、玻璃棒、量筒、天平。 四、实验步骤 1.双水相系统的制作
（1）配制牛血清蛋白溶液：1g/L
（2）配制高浓度的聚合物和盐溶液母液：PEG6000，400g/L、硫酸铵400g/L 各20ml。 （3）配制相应的高聚合物子液（60 g/L,100 g/L,140 g/L）和盐的子液（140 g/L,140 g/L，140 g/L）各4ml
（4）将高聚合物子液和盐的子液转到10ml离心管中，加入牛血清蛋白2ml，共三组。离心管封口后，反复倒置5-10min，6-10次/分钟。使充分混合。
（5）1500R/min下离心3-5min后，观察情况。
（6）小心吸取目标物，加入双缩脲试剂进行定性鉴定。 五、注意事项
1.离心前，必须配平。
3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。
4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。 六、思考问题
1双水相萃取蛋白的优点。
2 双水相萃取成相的影响因素有哪些？
实验四 机械剪切法细胞破碎实验及PPO的粗提
一、实验目的
1.熟悉细胞破碎的基本方法 2.熟练掌握机械破碎法操作技术 二、实验原理
细胞破碎技术（包括机械破碎法：捣碎法、珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法；非机械破碎法：冻结-融化法、渗透压冲击法、有机溶剂法、表面活性剂法、酸碱法、酶溶法）是提取分离生物药物的一个基本技术，是一项必须掌握的基本技能）。 三、材料、试剂及仪器 1.材料：土豆 2.试剂
（1）0.1mol/L的NaF溶液（4.2gNaF溶于1000ml水中）；
（2）0.1mol/L的邻苯二酚溶液（1.1g邻苯二酚溶于1000ml水中，用稀NaOH调节溶液pH为6.0）。 3.仪器
家用匀浆机，烧杯，布氏漏斗，抽滤瓶，量筒，容量瓶，普通离心机，水浴锅，不锈钢锅。 四、实验步骤 1.酶抽提物的制备
（1）拿一块土豆，洗去上面的泥土； （2）去土豆皮后切成小块；
（3）称取50g土豆块放入匀浆机中，再加入50ml氟化钠溶液； （4）在匀浆器中研磨30s；
（5）把匀浆物通过几层细布滤到一个100ml的烧杯中；
（6）加入等体积的饱和硫酸铵溶液（70g硫酸铵溶于100ml水，加热到70-80℃使其溶解，冷却到室温后过滤，即得饱和硫酸铵溶液），混合后于4℃放置30min； （7）在4000r/min下离心15min，倒掉上清液；
（8）将沉淀物用大约15ml柠檬酸缓冲液（pH=5.6，将0.1mol/L的A液柠檬酸和0.1mol/L的B液柠檬酸三钠按5.5：14.5的比例混合），既得该酶粗制品。 2.多酚氧化酶的颜色反应
（1）将3只干净的试管编号为1、2、3. （2）按下面的要求制备各管： 管号 1 2 3 酶抽提液 15滴 15滴 水 15滴 15滴 邻苯二酚（0.01mol/L） 15滴 15滴 混合均匀