实验十四 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质（选做）
一、实验目的
（3）了解盐析法分离血清中主要蛋白质的基本原理； （4）掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术。 二、实验原理
盐析是最常见的分离蛋白质的方法，各种蛋白质所带的电荷不同、相对分子量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉淀下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。一般粗提物常用它进行粗分离。
常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，其中最常用的是硫酸铵。用盐析法分离蛋白质简单安全，而且所得的蛋白质并不丧失活性，是分离纯化中最佳的一种方法。在实际操作中，可先将蛋白质调到等电点，使其溶解度达到最低，然后加入粉末固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，并达到一定浓度，这时蛋白质即从溶液中析出，经过滤或离心，透析除去盐，即可获得产品。
硫酸铵的浓度一般以饱和度表示，在不同温度下达到一定饱和度所需浓度不同，详见附表。 五、实验仪器
离心机、大烧杯（≥500ml）、烧杯（250ml）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。 四、材料和试剂 1.材料
新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）100ml。（为使血不凝固，可按血：10%柠檬酸钠=2：1的比例配制） 3.试剂
（3）pH7.2的饱和硫酸铵溶液（用氨水调节pH）； （4）0.2mol/LpH7.2的磷酸缓冲液（PBS），配制方法如下：
A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（5.37g磷酸氢二钠加去离子水精确配制100ml）； B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（3.12g磷酸二氢钠加去离子水精确配制100ml）； 取A液72ml，B液28ml，边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100ml浓度为0.2mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液备用。 六、实验步骤 1.清蛋白与球蛋白分离
（1）取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS100ml搅拌10min。 （2）在搅拌下慢慢滴加200mlpH7.2饱和硫酸铵溶液。
（3）加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20-30min以充分沉淀球蛋白。
（4）离心（3500r/min）20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。
2.各种球蛋白的分离
（1）用100mlPBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml烧杯中搅拌15min。 （2）在搅拌下，慢慢滴加25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达20%。 （3）离心（3500r/min）20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液。
（4）上清液在搅拌下，慢慢滴加18-25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达30%-33%。 （5）离心（3500r/min）20min得上清液和沉淀（主要含γ-球蛋白和少量β-球蛋白）。 （6）取（5）中的沉淀溶于PBS中使体积达100ml并转移至250ml烧杯中搅拌15min。 （7）在搅拌下，慢慢滴加43-50ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达30%-33%。
（8）离心（3500r/min）20min得上清液（含β-球蛋白）和沉淀（主要含γ-球蛋白）。 （9）取（5）中的上清液在搅拌下，慢慢滴加35-40ml饱和硫酸铵溶液，饱和度约达45%。 （10）离心（3500r/min）20min得上清液（含α-球蛋白）和沉淀（主要含β-球蛋白）。 七、结果与分析
（1）观察每一次沉淀后的清液和沉淀，记录上清液和沉淀的状态和质量。 （2）如果要对不同组分所包含的主要成分进行验证可采取哪些方法？ 八、注意事项
（1）缓冲液的配制应准确
（2）滴加饱和硫酸铵溶液的速度要慢一些，搅拌的速度应适中。 （3）加完硫酸铵溶液后要静置一段时间，至少20-30min，使沉淀完全。
为证明分离的效果，可和实验“凝胶层析法测定蛋白质分子质量”配合进行。