蛋白质的定量测定——Folin-酚法
一、目的要求
（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法； （2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理
（一）蛋白质定量测定的方法
目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。 （二）Folin—酚法原理 1. 原理
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合
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物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250ug蛋白质 2. 优缺点
目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。缺点是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
三、试剂和器材
（一）试剂 Folin—酚试剂: 试剂甲：
1) 4%碳酸钠溶液
2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 3) 1%硫酸铜溶液
4) 2%酒石酸钾钠溶液。
临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。
试剂乙：
称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。
试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。 （二）标准和待测蛋白质溶液
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150ug/ml蛋白溶液 2. 待测蛋白质溶液
人血清，使用前稀释100倍。
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（三）器材
试管及试管架；0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，722型分光光度计。
四、操作方法
（一）制作标准曲线
取14支试管，分两组按下表平行操作： 试管编号 试剂处理 标准蛋白质溶液/ml 蒸馏水/ml Folin-酚甲试剂/ml Folin-酚乙试剂/ml 0 1.0 5.0 0.5 0.1 0.9 5.0 0.5 0.2 0.8 5.0 0.5 0.4 0.6 5.0 0.5 0.6 0.4 5.0 0.5 0.8 0.2 5.0 0.5 1.0 0 5.0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 摇匀，于20—25℃放置10min 迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色 A640 注：由于这种显色化合物组成尚未确定，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区。不同书籍选用不同的波长，有选用500或540nm的，有选用660,700或750nm的。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。本实验选用640nm。
绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
（二）未知样品蛋白质浓度测定
取4支试管，分2组，按下表平行操作：
试管编号 试剂处理 血清稀释液/ml 蒸馏水/ml Folin－酚甲试剂/ml Folin－酚乙试剂/ml 空白管 ×2 0 1.0 5.0 摇匀，于20—25℃放置10min 0.5 0.5 迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色 A640 样品管 ×2 0.2 0.8 5.0 （三）计算
蛋白质（g)/100ml血清?A640值对应标准曲线蛋白质测定时用稀释血清的含量?10ml数?6?血清稀释倍数?100
五、注意事项
(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。 (2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。
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实验二 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
一、实验目的
1. 学习和掌握SDS－PAGE垂直板电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。 2. 掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
二、实验原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性和定量分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE 是在要进行电泳分析的样品中加入含阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二、三级结构；β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，置沸水浴中煮沸3～5 min，使SDS与蛋白质充分结合，引起蛋白质变性、解聚、带上大量同种负电荷、形成棒状结构。样品处理液中通常加入溴酚蓝染料作为电泳指示剂，用于控制电泳过程（溴酚蓝指示剂为一种小分子物质，可以自由通过凝胶孔径，用它可显示电泳的前沿位置）。此外，样品处理液中还可加入适量蔗糖或甘油以增大溶液密度，便于加样时样品溶液沉入样品凹槽底部，防止加样时产生对流扩散。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，一般分离大分子量蛋白质需要使用较低浓度的分离胶；分离小分子量蛋白质需要使用较高浓度的分离胶。当分离胶聚合以后，通常要在凝胶上面加上一层约1 cm厚的浓缩胶，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶的pH值较低（通常pH6.8）、浓度较低（通常为3～5％），形成的孔径大，各种蛋白质都可以自由通过，常用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后通电即可电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统即连续系统与不连续系统，不连续系统中存在着三种不连续性即pH不连续、凝胶不连续、溶液离子组成不连续。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据各自分子量的大小而被分离。
三、试剂与器材
1．器材
①夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×100×1.5mm）（北京六一仪器厂） ②直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA） ③吸量管（1,5,10 ml）
④烧杯（25,50,100 ml） ⑤细长头的滴管
⑥1ml注射器及6号长针头
⑦微量注射器（10μl或50μl） ⑧水泵或油泵 ⑨真空干燥器
⑩培养皿（直径120mm） 2．试剂
（1）标准蛋白质
目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SD S-PAGE测定未知蛋白质分子量。
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①高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品，表中2-1）。
表2-1 5种标准蛋白质
蛋白质名称 甲状腺球蛋白 铁蛋白 过氧化氢酶 乳酸脱氢酶 血清清蛋白 Mr 669 000 440 000 232 000 140 000 67 000 来 源 猪甲状腺 马 肺 牛 肝 牛 心 牛 血 清 注：按说明书要求处理 ②低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表2-2）。
表2-2 5种标准蛋白质
蛋白质名称 磷酸化酶B 牛血清蛋白 肌动蛋白 磷酸酐酶 烟草花叶病毒外壳蛋白 Mr 94 000 67 000 43 000 30 000 17 500 ③自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心细胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25 000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35 000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血清白蛋白（Mr67 000）等蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 （2）不连续体系SDS-PAGE有关试剂
①10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
②1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。 ③10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。
④样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol·l-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液。 ●先配制0.05mol·l-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml 1mol·l-1 HCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。 ●按表2-3配制样品溶解液。
表2-3不连续体系样品溶解液配制
SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 0.05mol·L-1Tris-HCl 加重蒸水至最后总体积为 100mg ⑤凝胶贮液
0.1ml 2mg 4g 2ml 10ml *如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 ●30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
●10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 ⑥凝胶缓冲液
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●分离胶缓冲液（3.0mol·lpH8.9 Tris-HCl缓冲液）：称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol·lpHCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。 ●浓缩胶缓冲液（0.5mol·L-1 pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，
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再加1mol·l HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4℃贮存。 ⑦电极缓冲液 四、操作步骤：
（一）安装夹心式垂直板电泳槽
关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图16-4。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个 形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：
1、将长、短玻璃板分别插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 2、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
3、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 4、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。 （二）配胶及凝胶板的制备
1．配胶
根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表16-5和表16-6。 表16-5 SDS-不连续体系凝胶配制
电极缓冲液为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。
电极缓冲液为0.1mol·l-1pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。 2．凝胶板的制备
（1）SDS-不连续体系凝胶板的制备
●分离胶的制备：按表16-5配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min